2024年 7月 23日, 星期二
新闻

从脾脏、胸腺和淋巴结制备小鼠细胞悬液

材料

  • RPMI-5 或DMEM-5 完全培养基
  • 新鲜分离的小鼠器官: ≤6 周龄的小鼠胸腺; 6 周至6 个月龄的小鼠脾脏和淋巴结
  • 60mmX15mm 培养皿
  • 剪刀和镊子(保存在70 %乙醇的烧杯中)
  • 装有19G 针头的6ml 注射器
  • 200μm 尼龙滤网

步骤

  1.  将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培养基的60mmX15mm培养皿(每种器官一个培养皿)中, 用剪刀将器官剪碎。
  2. 用6ml 注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直到仅剩纤维组织。
  3. 用装有19G 针头的6ml 注射器将组织悬液反复抽吸数次,以进一步粉碎组织团块。
  4. 将细胞悬液通过200μm 尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml 完全培养基洗一次培养皿,如需要则重复一次,之后将洗液通过滤网加入离心管中。
  5. 在离心机中以1000r/min (200g) 离心10min 后弃上清 。用20ml 完全培养基将沉淀重悬后离心,再以适量培养基重悬以便计数 。
  6. 如细胞不能立即处理,最好的保持细胞活力的办法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失 。

如何去除脾脏细胞悬液中的红细胞?

脾脏细胞悬液在进行淋巴细胞计数之前最好先去除红细胞(RBC) 。胸腺和淋巴细胞悬液则不必去除红细胞。脾脏细胞的亚群分离也需先去除红细胞。

附加材料

  • ACK 裂解缓冲液

步骤

  1. 每个脾脏用约5ml 裂解缓冲液悬浮脾脏细胞;一个12ml 试管可用于裂解一个或两个脾脏,也可以用50ml 离心管裂解更多的脾脏。
  2. 室溫孵育5min ,间以摇动。
  3. 加入洗液直至装满容器,在低速离心机上以200g 离心10min 后弃上清。再洗沉淀一次并以适量培养基重悬以便下一步操作(如去除死细胞、细胞计数或者细胞分离)。

一步梯度法去除死细胞

下面介绍的方法,其基本原理是基于活细胞(密度较小)和死细胞(密度较大)密度不同,从而有助于将活的淋巴细胞与红细胞分离。

附加材料

  • 高密度溶液: Ficoll-Paque (Ficoll 和泛影酸钠; Pharmacia LKB) 或Lympholyte-M(Cedarlane)
    12ml 或50ml 聚丙烯离心管(比聚苯乙烯离心管好)
  • 注: Ficoll-Paque 和Lympholyte-M 的密度与温度有关;该方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液适合在室温中使用。因此应注意使细胞悬液、离心和高密度溶液控制在室温。否则会因活细胞沉入离心管底导致在密度界面上损失活细胞。

步骤

  1. 用RPMI-5 完全培养基混悬细胞, 分装到离心管中使其细胞数达到 0. 5X108~ 1 X108个细胞/2ml (12ml 离心管)或 1X 108~ 5 X 108 个细胞/5 ml (50ml 离心管)。
  2. 用移液器吸取3ml (使用12ml 离心管时)或5ml (使用50ml 离心管时)高密度溶液, 将枪头伸到离心管底,缓慢将高密度溶液加入细胞悬液下方。
  3. 室温, 800g 离心15min。为了取得好的分离效果,最好将离心机的”brake” 开关关掉。
  4. 使用5ml 移液器,沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头, 吸入漂浮在高密度层上方的活细胞, 尽量少收集高密度溶液。将活细胞移入另一管中。
  5. 加入RPMI-5 完全培养基(少量细胞加入10ml , 细胞量较多时加入40ml) ,室温,200g 离心10min。重复一次。
  6. 以适量培养基混悬细胞以便进行下一步操作。

Check Also

用AUTOMACS 系统进行总T 细胞、CD4^+细胞或CD8^+ T细胞的自动分离

材料 小鼠 HBSS 洗涤缓冲 …

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注