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Western-blot化学发光实验为什么会出现高背景?

     做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现,要弄清楚“背景太高”的原因,先要知道“背景”是什么,“背景”也是发光,影响发光的因素就会影响背景。
    影响发光的因素主要有:1.含HRP的抗体;2.发光试剂;3.和发光试剂反应的杂质,如含杂质的膜。这里面,在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的,抗体浓度过高,洗涤不充分,封闭不充分等都可以造成抗体在膜上的非特异结合,制造背景;转移膜包括最后曝光时包裹的塑料薄膜,含有杂质也会制造背景,这种背景较容易发现鉴别。
    值得注意的是,发光试剂不好,也会制造背景,这在较长时间曝光的情况下明显,有人做过实验,在较长曝光(30分钟以上),优质的发光试剂背景明显较一般的发光试剂背景低,得到的图像也更漂亮,结果也更可靠。
    对一些实验来说,如果实验结果本应是多条带,只是一些带由于蛋白量多较强,短时曝光即可检测,而另一些带由于蛋白量相对较少,需要长时间曝光才可检测,这时候主要的影响因素就是发光试剂,因为如果加大抗体的量,普通的发光试剂背景也会相应加大,影响较弱条带的检测,如果减少抗体的量,普通的发光试剂较弱条带不易检测,长时间曝光同样隐藏在背景之中。这时如果不知道还有较弱条带的存在,实验的结论实际上被发光试剂影响了。如果有能长时间曝光而低背景的发光试剂,那么得到的结果就会非常可靠。
    所以,较好的抗体和实验过程,再采用优质的发光试剂,如Enlight等ECL发光液,就可以减少背景,得到漂亮、真实、可靠的发光结果。

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