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怎样纯化信号通路关键性酶?

着老龄化的不断加剧,癌症逐渐成为威胁人类生命和健康的最可怕的敌人。为检测药物对肿瘤信号通路关键酶的作用,实验中经常通过基因重组技术,获得大量的外源性蛋白,并通过体外酶活检测来筛选化合物,为细胞水平和体内检测提供很好的基础。下面就如何纯化肿瘤信号通路关键性酶进行简单的介绍。

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1、获得重组质粒
1)通过查阅文献或者资料,找到目标蛋白存在的细胞类型以及序列的CDS区,并明确各个功能域的功能,选择含有化合物结合位点的区域;2)对相关细胞进行RNA的提取并反转录成cDNA;3)针对表达系统选择合适的质粒,并且建议质粒上带有亲和标签,如His-tag、FLAG-tag、GST等,以便于蛋白的表达和纯化;4)设计针对CDS区的相应引物,以cDNA为模版PCR,并对PCR产物和质粒进行酶切和连接,菌体PCR验证之后提质粒,最后进行测序。

2、选择合适的表达系统
1)大肠杆菌表达系统 是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统,此系统具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达产物容易纯化、稳定性好等优点。所以在表达过程中首选大肠杆菌表达系统。但同时该表达系统也有明显的缺陷,如表达产物(蛋白质)缺少翻译后修饰,高表达时易折叠错误导致表达产物没有活性。重组蛋白在高效的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠过程中的酶和辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键,从而形成包涵体。 因此针对可溶性的蛋白可以直接进行纯化,而对于包涵体需要进行适宜的变性和复性的过程获得正确折叠的目的蛋白。
2)酵母 是单细胞低等真核微生物,其表达产物可以糖基化且属分泌型表达,有利于蛋白的分离纯化,能适应工业化生产的需要易培养、繁殖快、遗传背景清楚,便于进行遗传操作。但是,由于通过酵母表达系统表达的外源蛋白质可能形成聚合体而影响表达效率,其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等,可造成表达产物的差异,为表达产物纯化和工业化生产带来了困难。
3)哺乳动物表达系统
此系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势。因此适合表达完整的大分子蛋白,但哺乳动物表达系统构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低,且有时会导致病毒感染。针对不容易表达或者无法以分泌的形式表达的蛋白可以连接有igg的fc片段,使其转然后分泌到细胞外,便于纯化。

3、合理纯化蛋白
针对相应的标签选择适宜的方式进行纯化,如His-tag,组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在pH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的功能基本上无影响。组氨酸是具有杂环的氨基酸,每个组氨基酸含有一个咪唑基团,这个化学结构带有很多额外电子,对于带正电的化学物质有静电引力,亲和层析是利用这个原理来进行吸附的,亲和配体(也就是填料)上的镍离子带正电对组氨酸有亲和作用。

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