英格恩技术博客 专注转染等实验

对次生细胞壁合成进行转录调控的技术路线

材即是木本植物的次生木质部,包含木本植物光合作用产生的绝大部分生物量,是制浆造纸工业、建筑业、纺织业以及新兴的生物能源产业的重要原材料。

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木材的形成主要依赖于次生木质部的年度周期性生长和累加。木材主要由纤维素、木质素和半纤维素三种成分组成,也就是我们通常所说的纤维生物质。在植物所积累的太阳能中,90%以上是以纤维生物质形式存在。因此,木材在生产应用过程中,我们只有对其进行材性改良才能更好的得到利用,如木材材性改良可用于造纸,因为制浆造纸实质是脱木质素的过程,脱木质素需要使用大量的化学品,由此产生大量的造纸废液,所以对次生细胞壁进行调控以降低木质素含量,或改变木质素的结构使之易于脱除,可改善制浆性能。

同样的,木质纤维生物质能源植物的改良主要是通过生物技术的手段改变生物质组分促进糖转化:1、改变纤维素和木质素比例;2、改变木质素结构;3、改变纤维素结构;4、降低木质素含量,提高纤维素含量。因此材性改良对生物质能源生产率的提高至关重要。具体操作如下:以杨树为例

首先我们需通过查阅资料确定候选基因,确定后对其进行研究。

研究内容主要包括:
1  生物信息学分析,挖掘杨树基因组中与木质素合成相关的基因和   与材性   改良相关的xx转录因子的基因信息 ;
2    基因组织特异性表达分析;
3  基因的亚细胞定位;
4   构建过表达和抑制表达载体,转化杨树;
5   解析调控基因的功能。

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具体步骤如下:

1、分离候选基因
通过同源性分析的结果,我们根据毛果杨序列设计引物,以2个月塔形毛白杨幼苗总cDNA为模版,通过PCR扩增毛白杨中候选基因的全长编码区。通过琼脂糖凝胶电泳检测,提取目的片段并进行测序,利用生物信息学软件对候选基因转录因子系统进化进行分析。

2、候选基因组织表达特异性分析
通过Real-Time PCR检测不同组织(老叶、嫩叶、第九结节的茎)候选基因的表达水平。由于杨树茎的发育生长直接与木材形成的次生生长有关,通过该实验结果来推测候选基因是否在林木的次生生长过程中起重要作用。

3、候选基因亚细胞定位
选取一个广泛使用的报告基因,将其融合到候选基因下游使之处于同一个读码框中。采用基因枪轰击洋葱表皮法获得重组载体PGreen0029-候选基因-报告基因的瞬时表达,随后利用激光共聚焦显微镜观察。结果显示,带有35s的空载体可正常表达,带有候选基因的融合蛋白定位在细胞核内。证明了候选基因定位在细胞核内,该蛋白在植物体内为转录因子,调控着下游基因的表达,进而调节植物的生长发育。

4、植物表达载体的构建及转化植物
利用gateway方法构建植物表达载体。
利用根癌农杆菌转化杨树。

5、对转基因植物进行检测
若获得转基因植物可对其进行生长发育及生理生化分析(木质素沉积部位、木质素含量、纤维素含量等变化)

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