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世界上最遥远的距离之荧光定量PCR

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世界上最遥远的距离不是天涯海角,而是我天天和你在一起,你却不了解我。

荧光定量PCR常做,相关概念常说,可它们到底啥意思?

荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念

基线(Baseline):是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,这样的直线即是基线。

荧光域值(threshold)的设定:一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。

CT值:表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图片1

判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面:

1、曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显,扩增曲线整体平行性好,基线平而无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比,斜率越大扩增效率越高。

3、标准的基线平直或略微下降,无明显的上扬趋势。

4、各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。

图片2

熔解曲线
对PCR产物加热,随着温度的升高,双链扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同,因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同,可通过此对PCR的特异性进行鉴定。

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