世界上最遥远的距离之荧光定量PCR

世界上最遥远的距离不是天涯海角，而是我天天和你在一起，你却不了解我。

荧光定量PCR常做，相关概念常说，可它们到底啥意思？

荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念

基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。

荧光域值（threshold）的设定：一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。

CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：

1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。

3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。

4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。

熔解曲线
对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。

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