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Real-time qPCR实验设计—-从开始到结束

实验设计其实比实验本身更重要!!好的实验设计可以事半功倍,节省时间节省时间!!尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分析原因,才有可能创新。

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一、 对于一个real-time qPCR而言,首先就是实验材料的处理和料;然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的50%;进行实验和数据分析(这一部分单独说明)。

 

  1. 实验材料的处理和准备
    在材料收集过程中,尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品)。
  2. 引物设计

一般real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则:

  • 扩增产物长度在80-150bp。
  • 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
  • 产物不能形成二级结构。
  • 产物长度一般在15~30碱基之间。 G+C含量在40%~60%之间。 碱基要随机分布。
  • 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
  • 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
  • 引物5’端可以修饰。
  • 引物3’端不可修饰。
  • 引物3’端要避开密码子的第3位。

 

  1. Taqman® 探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。遵循下面以下原则:
  • 尽量靠在上游引物;
  • 长度30-45bp,Tm比引物高至少 5℃;
  • 5’端不要是G,G会有淬灭作用,影响定量

 

二、Real-time qPCR操作过程操作过程

  1. RNA提取和反转录:全程佩戴一次性手套。
  2. Mix配制:一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1µl或者1µl的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。

3.仪器设置

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)。

A.首先是实验目的选择:定量还是其他。

  1. 实验方法的选择: 如,比较Ct的SYBR Green方法,Fast程序,以cDNA为模板进行。
  2. 目的基因的设置:有几个目的基因和目的基因的名称。
  3. 样品的设置: 包括哪个是实验组,哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置
  4. 对照组和内参基因的设置: 这个是为后面的定量做准备的
  5. 反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。循环反应是9X℃ X秒,X℃ X秒的X个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
  6. 反应体系的设置:

A-G这五个步骤这五个步骤简单设置好,可以保存,修改修改反应程序或者立刻进行反应。

4.设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN !

 

三、Real-time qPCR数据分析

  1. 基线(baseline)

通常是3-15个循环的荧光信号

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线

  1. 阈值(threshold)

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

  1. Ct值 :与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。

  1. Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光

发射强度的比值。

  1. Rn△:Rn△是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn = Rn–基线)。

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