蛋白和酶

常见问题                                         …

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体 …

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …

• 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 • 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 • 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 • 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。 …

荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带 …

ChIP的一般流程： 甲醛处理细胞—收集细胞，超声破碎—加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合—洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联，纯化富集的DNA-片断 …