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Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因?

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生,经常有朋友反映,加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光,可亮光很快就消逝了,压完片后,条带却很弱,甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么?

要解释这种情况发生的原因,必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化,产生荧光,这个过程被发光增强剂加强,增强剂在HRP-鲁米诺-H2O2体系中扮演着核心角色,决定着ECL化学发光的发展。理想的发光增强剂是:1.发光灵敏,目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上,可以检测pmol甚至fmol级别的HRP,发光的灵敏度实际上已不是问题。2.发光稳定,这是目前研究的重点之一,发光不稳定的增强剂,容易在一些情况下发生“淬灭”,即快速消耗发光试剂,在几秒钟内发强光,又在几秒钟内迅速消逝,不容易被检测的现象。3.本底或背景低,这是发展的方向之一,由于化学发光反应对增高本底的因素很敏感,因此,化学发光分析欲得到准确可靠的结果,就必须确保试剂的特异性,在无HRP或很少HRP的情况下,不发光或很少发光。

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所以,Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面:含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂,人们多注意了抗体,不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说,可以采用适当降低抗体的浓度,发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题;对发光试剂来说,可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。

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