英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
可使用病毒感染增强剂envirus提高病毒的感染效率，下面以慢病毒为例，说一下实验过程。 1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中，以感染时细胞融合度在50%左右为宜(悬浮细胞根据需要调整，不要采用过高的细胞密度)。 2.感染 ⑴将2ul的EnvirusTM-LV用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成EnvirusTM-LV稀释液。4℃静置5 …
阅读更多 »细胞转染效率低的原因是什么？
转染效率低的原因可从以下几方面找： 1.质粒DNA或混和液中含有血清。 对策：用无血清培养基或Opti-MEM培养基。 2.质粒DNA和转染试剂的比率不是最优 对策：对大多数细胞而言，质粒DNA和转染试剂的比例为1:2-1:3，一般要做优化实验，比例从1:0.5-1:5 逐一检测。 3.质粒DNA 已部分降解或质量不够好 对策：用好的质粒纯化试剂确保质粒DN …
阅读更多 »从脾脏、胸腺和淋巴结制备小鼠细胞悬液
材料 RPMI-5 或DMEM-5 完全培养基 新鲜分离的小鼠器官: ≤6 周龄的小鼠胸腺； 6 周至6 个月龄的小鼠脾脏和淋巴结 60mmX15mm 培养皿 剪刀和镊子（保存在70 ％乙醇的烧杯中） 装有19G 针头的6ml 注射器 200μm 尼龙滤网 步骤 将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培养基的60mmX15mm培 …
阅读更多 »细胞电转染实验应注意事项
1. 选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. …
阅读更多 »RNA转染效率低的原因
RNA转染效率低，可能的原因： 1. 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂，如Entranster。 2. 转染试剂和RNA的量不够，或者比例不对。优化实验条件，调整试剂和RNA用量，优化二者比例。 3.检测时间有问题。适当调整检测时间。 4. RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 5. 细胞状态不佳。调整细胞状态，调整细胞融合度。
阅读更多 »悬浮细胞的siRNA转染实验步骤
悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为2 …
阅读更多 »血清对于细胞转染效率有什么影响？
血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。这些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h在更换成有 …
阅读更多 »怎样纯化信号通路关键性酶?
随着老龄化的不断加剧，癌症逐渐成为威胁人类生命和健康的最可怕的敌人。为检测药物对肿瘤信号通路关键酶的作用，实验中经常通过基因重组技术，获得大量的外源性蛋白，并通过体外酶活检测来筛选化合物，为细胞水平和体内检测提供很好的基础。下面就如何纯化肿瘤信号通路关键性酶进行简单的介绍。 1、获得重组质粒 1）通过查阅文献或者资料，找到目标蛋白存在的细胞类型以及序列的CD …
阅读更多 »电转染实验时，DNA有什么要求？
使用高纯度、无菌和无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA要求无内毒素，OD值为1.8-2.0。不建议使用微型核酸制备试剂盒准备DNA，因为它可能含有高水平的内毒素。 不要使用仅用乙醇沉淀法纯化的DNA。乙醇沉淀法中残留的盐会引起电流改变并对电穿孔产生负面影响。 建议DNA的浓度范围 …
阅读更多 »细胞转染实验方法有哪些？
1. 脂质体法。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质 …
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