细胞生物学

RNA转染效率低，可能的原因： · 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂，如Entranster试剂。 · 转染试剂和RNA的量不够，或者比例不对。优化实验条件，调整试剂和RNA用量，优化二者比例。 · 检测时间有问题。适当调整检测时间。 · RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 · 细胞状态不佳。调整细胞状态，调整细胞融合度。

可能的原因： 质粒竞争效应： 在共转染过程中，两个质粒可能在转染效率、复制能力或表达资源（如转录因子和核糖体）上竞争。一个质粒可能因此受到抑制，导致其表达量下降。 解决方法： 提高低表达质粒的比例，例如2:1或更高。 尝试使用等摩尔浓度（而非等质量浓度）的质粒来转染。 质粒质量或纯度差异： 低表达质粒可能存在降解、污染或纯化不完全的问题，从而影响其转染效率或 …

shRNA转染后，进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素，包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说，在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说： 24小时后：在这个时间点，可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA，这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …

1. 细胞培养： 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。 2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色： 1500rpm离心5min， …

单独电转mRNA（GFP）信号很好，但一旦同时把DNA一起电转，GFP荧光显著下降。这个往往不是“挤占表达资源”这么简单，更多是由“电转参数 + 细胞先天免疫反应 + 总核酸/盐负载”三方面共同导致。给你一个可操作、优先级排序的排障与优化清单（不需要额外设备就能尝试）： 先做两件最快见效的事 把DNA量往下砍 10–100×（起始试 10 ng～100 ng …

此分析方法基于用[3H] －胸腺嘧啶脱氧核苷标记核DNA, 用玻璃纤维滤器获得样品。 凋亡产生的DNA 片段小到可以通过玻璃纤维滤器，因此特定样品的放射活性减少。很显然，这种分析对循环的细胞是必需的。 实验前一天，将细胞接种于新鲜培养基。对数生长期细胞可更好地掺入[3H]－胸腺嘧啶脱氧核苷。 收获细胞，在新鲜培养基中以1×106细胞／ml重悬，用5 …

RNAi就是利用降解双链RNA的酶系统，人工引入一段和目标RNA互补的序列，这样，在细胞内形成双链RNA，诱发降解机制，使目标RNA降解，无法被进一步翻译。 在转染过程中，有人就在担心，dsRNA的稳定性是相对于单链RNA而言的！RNA怎么办？ RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合 …

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下mRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么 …

1.siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好？ siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR …