英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
可能原因： 1. RNA与转染试剂比例不佳。可进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳。 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。 3. RNA效率不高。选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。 4. RNA酶污染。建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。 5. 转染后培养时间不够。在mRNA水平可以到48 小时以后验证结果，在蛋白水 …
阅读更多 »都说RNAi很容易降解，转染效率很低，是真的吗？
RNAi就是利用降解双链RNA的酶系统，人工引入一段和目标RNA互补的序列，这样，在细胞内形成双链RNA，诱发降解机制，使目标RNA降解，无法被进一步翻译。 在转染过程中，有人就在担心，dsRNA的稳定性是相对于单链RNA而言的！RNA怎么办？ RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合 …
阅读更多 »逆转录病毒可以共感染吗？
可以。逆转录病毒（如MLV、lentivirus等）可以共感染同一细胞，尤其是不同病毒包装不同的转基因载体时，可以实现共转导（co-transduction），从而使同一细胞获得多个基因。 但要注意： 病毒滴度足够高：每个病毒的MOI（Multiplicity of Infection）需要合适，才有可能让同一细胞被两种病毒都感染。 标记或选择机制清晰：常用 …
阅读更多 »通过alamarBlue 法分析细胞活力
水溶性染料 alamarBlue 已用于体外定量多种类型细胞的活力( Fields and Lancaster 1993; Ahmed et al. 1994 ) 。该试剂极其稳定且无毒，因此可用于长时间连续监测细胞( Ahmed et al. 1994 ) 。基于上述原因， alamarBlue法被认为优于MTT 检测等经典的细胞活力检测方法。在一个比较实 …
阅读更多 »siRNA转染效率不理想的原因有哪些？
siRNA转染效率不理想，常见的原因有： 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率 …
阅读更多 »细胞转染注意事项
1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 3.培养基中的血清 在开 …
阅读更多 »细胞RNA转染注意事项
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »siRNA转染进细胞有哪些方法？
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术（Entranster）是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好 …
阅读更多 »如何解决病毒感染细胞效率低的难题？
病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2. 使用病毒感染增强剂Envirus-LV来提高感染效率。 病毒感染细胞本来效率就较低，整个过程相对复杂难操作，一般一次花费周期至少两三个月，多则几个月到十几个月不等，经费也是几万到十几万。万一实验失败需要重复操作会花费更多的时间和开支。所以有效提高病毒转染效 …
阅读更多 »问：现在是将构建好的质粒电转入到自制的感受态细胞里，质粒有10000bp，是90μL感受态细胞中加3.5μ质粒。我之前有电转过6000多bp的质粒，过夜培养可以长菌的。但是这个10000bp的质粒过夜培养没有单菌落，延长培养时间后有个别单菌落，但是挑单菌落到LB中并不浑浊。这种情况我是应该调整一下电转程序还是改一下加入质粒的量呢？
以下是详细的优化建议： 优化质粒用量（首要调整）： 问题： 你目前使用的是3.5µL质粒加入90µL感受态细胞。关键在于质粒的浓度（ng/µL），而不是体积。 3.5µL 对于90µL感受态细胞来说体积不小，如果质粒浓度较高，实际DNA量可能大大超过电转最优范围。 原理： 过量的DNA会导致电击时产生过多的热量和离子效应，严重降低转化效率，尤其对大质粒（&g …
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