英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
Q9: 刚开始做实验，准备把RNAi的片段转入染色体内稳定表达，不知道是shRNA还是siRNA哪个比较好而且效率比较高？另外，一个载体里同时放两个针对不同基因的shRNA会不会相互影响？ A9: 稳定转染当然是shRNA。关于一个载体2个shRNA，涉及到2个shRNA的表达和加工的问题，关键还是2个shRNA都需要顺利表达的问题，这就和你的载体，以及2个 …
阅读更多 »如何能够做好siRNA转染实验？
1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …
阅读更多 »siRNA转染效率不理想的原因
siRNA转染效率不理想，常见的原因有： 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率 …
阅读更多 »转染实验加药问题，做荧光定量是不是铺板的时候加药24小时后转染，做wb就是转染12小时后加药呢？
答：你描述的策略（铺板加药做qPCR，转染后加药做WB）是合理的，并且遵循了两种检测方法对时间需求的不同逻辑：qPCR关注转录早期/中期，WB关注蛋白积累的中/后期。 这不是唯一方案： qPCR： 有时也可以在转染后某个时间点（如6-12小时）加药，再培养足够时间（如再培养18-36小时）后收样，总处理时间也可能达到24-48小时。这取决于药物起效速度和你想 …
阅读更多 »高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备
一、试剂 CaCl2 溶液( 2mol/L )、完全培养基、DMEM 培养基、乙醇（或异丙醇） (70% )、胎牛血清( FBS )、HBS 溶液(2X)、HEPES (2.5mmol/L, pH 7.3)、OptiMEM+ 1 ％青霉素／链霉素( P/S )、OptiMEM , 无P/S、pCMVDΔR8.91 质粒、pUMVC 质粒、pVSV- G 质粒 …
阅读更多 »转染用的质粒，你提对了吗？
老板天天催着要实验进展，是不是很郁闷？可是细胞不给力，是不是很忧郁？刚刚复苏的细胞长的挺好的，可是转染后，细胞状态莫名其妙就变差了，是不是很伤心？转染试剂毒性大，换转染试剂？结果还是一样，是不是很无奈？勉强收了一点点细胞，可是还不够做个western blot的，是不是很抓狂？实验总是不能顺利进行，找不到原因，是不是都要吐血了？没人给指点迷津，是不是心都要碎 …
阅读更多 »电转染实验时，siRNA有什么要求？
使用高纯度、无菌的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。建议在250-750nM最终浓度范围内的进行siRNA不同浓度的梯度实验。建议设置一个非靶向或无意义的siRNA对照序列，以验证实验siRNA的特异性。同时也验证，针对单个基因用多个siRNA序列实验产生的表型是否是由于脱靶 …
阅读更多 »siRNA细胞转染过程中常见问题及解答
问：siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？ 答：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。 问：哪种转染试剂效果好？ …
阅读更多 »质粒DNA转染实验效率影响因素
1， 质粒的构建：启动子的选择 启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。 2， 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的 …
阅读更多 »细胞电转后，72小时铺板加药筛选是否可行
一般情况下，在细胞电转后进行72小时的培养再加药筛选是可以的。具体取决于你的实验设计和细胞类型。以下几点你可以考虑： 细胞恢复时间：不同的细胞系在电转后需要不同的恢复时间，一般48-72小时是常见的恢复窗口。确保细胞已经充分恢复正常的代谢和生长活动。 药物筛选时间：72小时后加药筛选通常是为了确保细胞稳定表达你引入的基因或者达到特定的实验状态。如果是抗生素筛 …
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