1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮 …
阅读更多 »细胞转染效率重复性差的原因是什么?
转染效率重复性差: 1. 细胞融合度不同。保证同样的接种量及同样的时间。 2.细菌污染。可使用Entranster试剂,培养基可加抗生素,避免细胞污染。 3.细胞传代次数太高了。可重新复苏一管新的细胞。 4.血清质量不稳定。用同一批号的血清。
阅读更多 »细胞siRNA转染有哪些方法?
siRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术(Entranster)是最为常用的方法,而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。
阅读更多 »细胞转染实验影响因素
转染效率受多种因素影响,主要因素有下面几个: 1.转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。 2.细胞状态 一般低的细 …
阅读更多 »怎样提高细胞转染效率?
1.选择合适的转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …
阅读更多 »请问siRNA转染后48h PCR已经敲低到30%以下,但是60h收蛋白,蛋白显著上调。是什么原因,如何在蛋白水平敲低呢?
对于您的问题,siRNA转染后48小时PCR显示基因表达水平已经显著降低到30%以下,但在60小时检测蛋白时,蛋白水平却出现显著上调,这种情况可能有以下原因和应对方法: 可能的原因: 蛋白降解滞后性:即使mRNA水平在48小时时已经显著下降,但蛋白的降解可能需要更长的时间。蛋白具有相对较长的半衰期,因此在mRNA水平下降之后,蛋白水平的下降会有一定的延迟。 …
阅读更多 »哺乳动物细胞同时表达2个质粒,如果采用相同的启动子,会不会形成表达竞争
是的,如果哺乳动物细胞同时表达两个质粒,且这两个质粒使用相同的启动子,它们可能会发生表达竞争(expression competition)。这种情况通常会影响两个质粒上基因的表达水平,具体影响程度取决于多个因素。 原因 转录因子的竞争: 启动子区域的转录因子结合位点是有限的。如果两个质粒使用相同的启动子,它们可能会争夺同一批转录因子。这种竞争会导致转录因子 …
阅读更多 »siRNA转染效率不理想怎么办?
siRNA转染效率不理想,常见的原因有: 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率 …
阅读更多 »Hela细胞的电转染条件是什么?
使用Entranster-E电转液与指数衰减脉冲电转仪时Hela细胞的电转染条件是: 对于0.2 cm电转杯,细胞密度为3×10^6 cells/ml,DNA用量为2μg,电转液体积为100μl,电压为130V, 电容为950μF。 对于0.4 cm电转杯,细胞密度为3×10^6 cells/ml,DNA用量为5μg,电转液体积为250μ …
阅读更多 »客户:做293T细胞转染,遇到了单转质粒过表达没有共转质粒过表达高是怎么回事?
回答: 1. 启动子竞争与转录因子的“稀释” 如果你在共转染中加入的是一个非表达质粒(载体骨架)或特定的辅助质粒,目标表达量反而增高,可能是因为单转染时目标质粒浓度过高,导致细胞内的转录因子被“过度征用”或者触发了细胞的应激机制。 适当的质粒比例:有时候少量的质粒反而能获得更稳定的转录效率,避免了转录机器的饱和。 2. 辅因子或辅助蛋白的协同作用(核心原因) …
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