英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
要想做好细胞的电转染实验，应注意以下几点： 1. 选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 选择合适的细胞 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内 …
阅读更多 »如何选择稳定转染的筛选抗生素？
稳定转染和瞬时转染，细胞转染的步骤基本相同，只是在转染后的细胞处理会不一样。由于瞬时转染只能维持几天，故在转染12～72后就可以在蛋白或基因水平进行相应的检测了。稳转细胞系通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 通常构建的载体上有两个抗性基因，如，氨苄青霉素和新霉素。那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来筛细胞呢？ 很多真核表达质粒上都 …
阅读更多 »细胞转染效率重复性差的原因是什么？
转染效率重复性差： 1. 细胞融合度不同。保证同样的接种量及同样的时间。 2.细菌污染。可使用Entranster试剂，培养基可加抗生素，避免细胞污染。 3.细胞传代次数太高了。可重新复苏一管新的细胞。 4.血清质量不稳定。用同一批号的血清。
阅读更多 »细胞RNA转染的几点建议
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »哺乳动物细胞同时表达2个质粒，如果采用相同的启动子，会不会形成表达竞争
是的，如果哺乳动物细胞同时表达两个质粒，且这两个质粒使用相同的启动子，它们可能会发生表达竞争（expression competition）。这种情况通常会影响两个质粒上基因的表达水平，具体影响程度取决于多个因素。 原因 转录因子的竞争： 启动子区域的转录因子结合位点是有限的。如果两个质粒使用相同的启动子，它们可能会争夺同一批转录因子。这种竞争会导致转录因子 …
阅读更多 »请问siRNA转染后48h PCR已经敲低到30%以下，但是60h收蛋白，蛋白显著上调。是什么原因，如何在蛋白水平敲低呢？
对于您的问题，siRNA转染后48小时PCR显示基因表达水平已经显著降低到30%以下，但在60小时检测蛋白时，蛋白水平却出现显著上调，这种情况可能有以下原因和应对方法： 可能的原因： 蛋白降解滞后性：即使mRNA水平在48小时时已经显著下降，但蛋白的降解可能需要更长的时间。蛋白具有相对较长的半衰期，因此在mRNA水平下降之后，蛋白水平的下降会有一定的延迟。 …
阅读更多 »RNA转染效率低的原因是什么？
RNA转染效率低，可能的原因： · 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂，如Entranster试剂。 · 转染试剂和RNA的量不够，或者比例不对。优化实验条件，调整试剂和RNA用量，优化二者比例。 · 检测时间有问题。适当调整检测时间。 · RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 · 细胞状态不佳。调整细胞状态，调整细胞融合度。
阅读更多 »RNA细胞转染过程注意事项
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »测序正确是不是说明shRNA构建没有问题
测序正确是一个重要的验证步骤，但它不能完全说明shRNA构建没有问题。下面我会具体说明为什么。 测序正确说明了什么？ shRNA序列（包括发夹结构、目标序列）与设计一致： 如果你对构建后的质粒进行了Sanger测序，序列结果和你设计的shRNA完全一致，这说明你的克隆步骤（连接、转化等）是成功的。这意味着你至少在DNA水平上构建了正确的序列结构。 但这并不代 …
阅读更多 »为什么我的细胞转染实验效率较低？
1）实验条件优不佳：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其 …
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