分子生物学

在进行大多数RNA 分析之前， RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类：紫外(UV) 分光光度法，此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱； 基于荧光染料的方法，结合到核酸时选择性发荧光，测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的（ 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染），用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。 …

【试剂与器材】 （一）试剂 1． 0.1mol/L NaOH ，每组200mL 2． 寡聚Oligo（dT）-纤维素 3． 加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(p …

1. 无Ct值出现 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Ct值出现过晚（Ct>38） 扩增效率低: 反应条 …

将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。 SDS-PAGE蛋白质电泳 1）按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。 2）分离胶的制备 按下列成分配制10mL 12%分离胶： ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.5M Tris …

材料靶抗原： 表达于细胞的抗原，或蛋白质、多肽生理盐水无血清培养基：仅用于细胞接种弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant, CFA)实验动物： 无病原体大鼠、小鼠或仓鼠弗氏不完全佐剂(incomplete Freunds adjuvant, IFA)1~2ml玻璃注射器（有Luer-Lok 接头，已消毒）三通管100ml 烧杯20G …

条带弱的原因可能有以下几个方面： ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如英格恩的Enlight-plus。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。     影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充 …

蛋白质结构预测（Protein Structure Prediction）是一项利用计算方法预测蛋白质分子的三维结构的技术。由于蛋白质的功能很大程度上依赖于其三维结构，预测其结构对理解生物过程、药物设计等领域具有重要意义。然而，实验确定蛋白质结构（如X射线晶体学、核磁共振等方法）耗时费力，因此计算预测成为重要替代方法。 蛋白质结构预测的主要方法 同源建模（H …

【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …

小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法，通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应：小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接；以 …