英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析，离心机12 或16 管足够一次制备。 一、材料 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体，37’C 振荡培养 灭菌的微桩离心管 冰 溶液I （裂解缓冲液， 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/LEDTA) ，冰上预冷 溶 …
阅读更多 »shRNA转染后，什么时候做RT-PCR最好?
shRNA转染后，进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素，包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说，在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说： 24小时后：在这个时间点，可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA，这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …
阅读更多 »体外转录法制备dsRNA
该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。 试剂 琼脂糖凝胶( 1 %)复性缓冲液( 10 X)ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)DNA 分子质量标准dNTP 混合液，每种1 …
阅读更多 »SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 少量制备
该实验方案是从少量( l ~ 2mL ) 细菌培养物中分离质粒DNA 。DNA 产量为l00ng~ 5μg ， 这取决于质粒的拷贝数。少量的DNA 作为体外酶促反应的底物或者模板是足够的，但是，如果质粒DNA 用于测序则需要进一步纯化。 很多年以来， 碱裂解法提取质粒DNA 一直是标准的方法。如今，人们更倾向于用试剂盒提取。下列方案是早期实验的回顾。 材料 …
阅读更多 »RNA 定量-紫外（UV） 分光光度法
在进行大多数RNA 分析之前， RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类：紫外(UV) 分光光度法，此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱； 基于荧光染料的方法，结合到核酸时选择性发荧光，测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的（ 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染），用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。 …
阅读更多 »什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一 …
阅读更多 »应用长链dsRNA 抑制基因表达
在植物以及大多数真菌、非哺乳动物及其细胞系中，应用外源性长链dsRNA或者表达长反向重复RNA 转录物能够诱发细胞内相应mRNA 的降解(Fire et al 1998; Kennerdell and Carthew 1998; Misquitta and Paterson 1999) 。哺乳动物卵母细胞和dsRNA 诱导干扰素反应缺失的哺乳动物细胞系中，长 …
阅读更多 »原位杂交实验流程
1.探针的设计与合成 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，回收纯化。 引物编号 引物序列 长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp 目的片段克隆1）在无菌离 …
阅读更多 »如何制备双链siRNA？
本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺： 双丙烯酰胺（19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液（10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸，用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …
阅读更多 »为什么荧光原位杂交备受关注？
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 一 …
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