在进行大多数RNA 分析之前, RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类:紫外(UV) 分光光度法,此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱; 基于荧光染料的方法,结合到核酸时选择性发荧光,测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的( 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染),用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。 …
阅读更多 »原位杂交实验流程
1.探针的设计与合成 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列,用premier primer5.0设计引物p81和p82,以卤虫cDNA为模板,PCR扩增得到346bp的产物,回收纯化。 引物编号 引物序列 长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp 目的片段克隆1)在无菌离 …
阅读更多 »siRNA表达载体的构建
siRNA表达载体构建可以:(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具;(2)应用于基因组学、细胞信号传导通路分析;(3)用于药物靶点筛选、疾病治疗。 实验方法原理: 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启 …
阅读更多 »测序胶的灌制、电泳及处理
推荐用6 %丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶:一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息;另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程,采用6 %丙烯酰胺,可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶,使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »PCR、RT-PCR、qRT-PCR实验精髓
PCR PCR是很多科研者进入实验室做的第一个分子实验,名字听起来很高级,其实操作起来流程还是比较清晰明了,容易上手。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,用于放大特定的DNA片段,也可看作生物体外的特殊DNA复制。其中使用的Taq酶是1976年从温泉中的细菌分离出来的。它的特性在于能耐高温,是一个很理想的酶。PC …
阅读更多 »DNA 的 PCR 扩增
一、 PCR反应体系的组成 1.PCR扩增缓冲液: 50mM KCl10mM Tris HCl( pH8.0)1.5mM MgCl2 2.寡核苷酸引物:是按已知待扩增的DNA 片段序列进行设计,用 DNA合成仪合成。引物序列应位于DNA片段的保守区,两条引物间应注意不要有 …
阅读更多 »寡聚(dT)-纤维素柱层析法分离纯化mRNA
【试剂与器材】 (一)试剂 1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素 3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(p …
阅读更多 »PCR (多聚酶链式反应)
PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的,是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性,当温度降低时,DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合,在DNA聚合酶作用下,随着温度的缓慢提升,引物逐渐延伸,两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性,引物再次结合,DNA的合成再次进行,这样周而复始,重复20 …
阅读更多 »南京中医药大学:忍冬苷靶向EZH2减轻溃疡性结肠炎通过自噬介导NLRP3炎性体失活
结肠巨噬细胞内NLRP3炎症小体的异常激活与溃疡性结肠炎的发生发展密切相关。虽然靶向NLRP3炎症小体被认为是一种潜在的治疗方法,但其调节肠道炎症的潜在机制仍存在争议。 2021年3月9日,发表于Acta Pharmaceutica Sinica B(影响因子11.413)的一篇题为Lonicerin targets EZH2 toalleviate ulc …
阅读更多 »PCR-SSCP实验步骤
一.样品制备 1.PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测,上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 2.PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul SSCP上样缓冲液(变性缓冲液),然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验,扩增效果在琼脂糖胶 …
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