英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。 1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细 …
阅读更多 »细胞电转染实验的几点建议
1. 电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2 …
阅读更多 »电转染实验，如何设置正确的siRNA实验对照组？
1.设置空白对照组，检验细胞生长状态。 2.设置阴性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂 + 阴性siRNA。 3.设置阳性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂+ 靶向siRNA 转染管家基因，比如GAPDH 或者 Lamin A/C，之后通过western blotting 或者 mRNA quantif …
阅读更多 »电转染实验的建议
关于细胞的电转染实验，现提出以下几点建议供大家参考： 1. 选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 选择合适的细胞 用于 …
阅读更多 »细胞转染实验效率影响因素
1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …
阅读更多 »siRNA转染效率不佳的原因
1. siRNA与转染试剂比例不佳 由于siRNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了siRNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细 …
阅读更多 »siRNA转染实验的几点建议
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致 …
阅读更多 »影响RNA转染的因素
转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，因RNA与DNA大小不同，转染条件不同，所需的试剂也应不同，所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster-R4000. RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明，因为RNA …
阅读更多 »RNA细胞转染实验注意事项
进行RNA细胞转染实验时，应注意以下几点： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中R …
阅读更多 »两个shRNA在转录水平和蛋白水平都有效抑制了基因表达，但是表型做出来却不一致，是为什么？
这种情况可能是由多种因素引起的，以下是一些可能的原因： 转录水平和蛋白水平的不同调控机制：虽然shRNA能够有效地降低目标基因的mRNA和蛋白表达，但有时候蛋白质的功能并不完全依赖于其表达量。有可能是基因表达抑制后，细胞通过一些补偿机制（比如其他途径的上调或活化）来恢复其功能，导致表型不一致。 shRNA的特异性和脱靶效应：shRNA可能会靶向与目标基因相似 …
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