细胞转染

细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。 1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细 …

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …

为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致 …

1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以 …

可能的原因： 质粒竞争效应： 在共转染过程中，两个质粒可能在转染效率、复制能力或表达资源（如转录因子和核糖体）上竞争。一个质粒可能因此受到抑制，导致其表达量下降。 解决方法： 提高低表达质粒的比例，例如2:1或更高。 尝试使用等摩尔浓度（而非等质量浓度）的质粒来转染。 质粒质量或纯度差异： 低表达质粒可能存在降解、污染或纯化不完全的问题，从而影响其转染效率或 …

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …

慢病毒感染效率低，尽管用胶体金测试显示滴度很高，可能有以下几个原因： 病毒颗粒质量：虽然胶体金检测显示病毒滴度很高，但这并不意味着所有的病毒颗粒都是功能性的。有可能病毒颗粒已经失活或者结构受损，无法有效感染目标细胞。 病毒浓度与效价的差异：胶体金检测主要测量病毒颗粒的数量，但这些颗粒不一定都具有感染性。有效感染的病毒颗粒（感染性单位）可能比实际检测的数量要低 …

    传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如，阳离子脂质体。带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入 …

1.细胞密度 　　一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 　　这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 　　还有，尽量选择无 …

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …