英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致 …
阅读更多 »Hela细胞转染后死亡是什么原因？
可能有多种原因： 目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡； 转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害； 细胞贴壁转染之后没有正常换液。 建议： 考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统； 摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试Entranster转染试剂。 对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考 …
阅读更多 »为什么磷酸钙转染并不稳定？为什么磷酸钙转染并不经济？
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。 转染技术的选择对转染结果影响也很大。磷酸钙转染技术是 …
阅读更多 »RNA转染与人鼻病毒1B基因敲除和干扰素应答的再激活研究
人鼻病毒（HRV）是属于Picornaviridae家族肠道病毒属的单链正义RNA病毒。它在20世纪50年代首次被发现。将近60年后，已经鉴定出超过100种血清型/基因型病毒。HRVs（HV-A，-B，-C）是所有年龄组，尤其是儿童中呼吸道感染最常见的原因，但尚未开发出有效的治疗HVS的药物。现分享一篇RN …
阅读更多 »流式检测细胞周期操作步骤
流式检测细胞周期操作步骤 1. 细胞培养： 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。 2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色： 1 …
阅读更多 »细胞电转染效率不高的原因是什么？
细胞电转染效率不高，有可能是以下原因造成的： 1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2 …
阅读更多 »在慢病毒感染细胞的实验中，感染后细胞状态看起来正常，但传代培养后细胞死亡较多的原因
在慢病毒感染细胞的实验中，感染后细胞状态看起来正常，但传代培养后细胞死亡较多，这种情况可能与以下原因有关： 1. 慢病毒感染对细胞的潜在毒性 尽管慢病毒是常用的载体，感染后可能对细胞有一定的毒性： 病毒对细胞的应激反应： 病毒感染会引发细胞应激，可能暂时未表现出问题，但在传代过程中细胞状态恶化。 载体元件的毒性： 慢病毒载体中的某些元件（如强启动子）可能会对 …
阅读更多 »细胞铺板密度对于siRNA转染为什么很重要？
RNA转染试剂Entranster-R4000成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高，一些试剂由于本身毒性的影响，太低的细胞数量时毒性明显，所以会要求较高的细胞密度（汇合度），顺便说一句，看一个转染试剂 …
阅读更多 »有Lenti序列的质粒可以直接转染目标细胞吗
带有Lenti序列的质粒通常不能直接转染目标细胞来实现功能，因为这些质粒设计的初衷是通过病毒介导的基因转导。慢病毒系统需要经过病毒包装步骤后才能有效感染并整合到目标细胞的基因组中。 原因： Lenti质粒本身无法感染细胞：Lenti载体质粒中虽然包含有病毒基因组的部分元件，但缺乏构成病毒颗粒所必需的结构蛋白。要将质粒中的基因传递给目标细胞，必须通过包装细胞来 …
阅读更多 »siRNA转染至细胞有哪些方法？
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术（Entranster）是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好 …
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