英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶，当它们混合时会形成两相，水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时，蛋白质会进入酚相，再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。 一、材料 抗有机溶剂的塑料管，尝试尽可能小的体积，大多数的抽提可以在微量离心管中进行。 TE 饱和的酚：氯仿：异戊醇(25 : 24:1) 氯仿：异戊 …
阅读更多 »重叠延伸PCR实验
重叠延伸PCR实验 重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 实验方法原理: 此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶 …
阅读更多 »Trizol法提取总RNA的原理及注意事项
原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …
阅读更多 »Northern Blot原理及所需仪器、试剂
一、原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 二、仪器与试剂 仪器： 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器 …
阅读更多 »如何提高qPCR反应的灵敏度与特异性？
1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。 6. 设计引物时，避免在引物3’端含有 …
阅读更多 »荧光原位杂交会用到哪些试剂？
一、实验材料、试剂、仪器耗材： 人的MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20等恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等 二、相关溶液的配制 （1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 00 …
阅读更多 »丁醇抽提法浓缩核酸
用仲丁醇（ 2 －丁醇）或正丁醇（ 1 － 丁醇）等溶剂萃取水溶液时，部分水分子会进入有机相，而核酸依然留在水相。重复抽提几次后可显著减少核酸溶液的体积。这一浓缩方法可用于减少稀溶液的体积，以使核酸易于通过乙醇沉淀得到回收。 试剂 DNA 样品 异丁醇 方法 计算核酸溶液体积，在2 5 °C 下加入等量的异丙醇。轻微、充分混匀两相。 加入过多的异丙醇 …
阅读更多 »DNA 的 PCR 扩增
一、 PCR反应体系的组成 1.PCR扩增缓冲液： 50mM KCl10mM Tris HCl( pH8.0)1.5mM MgCl2 2.寡核苷酸引物：是按已知待扩增的DNA 片段序列进行设计，用 DNA合成仪合成。引物序列应位于DNA片段的保守区，两条引物间应注意不要有 …
阅读更多 »异丙醇法沉淀DNA
DNA 在含有异丙醇的溶液中比在含有乙醇的溶液中难溶。乙醇沉淀法需要2 ~ 3 倍体积的乙醇，异丙醇沉淀则需要0.6 ~ 0.7 倍的体积。沉淀大体积溶液中的DNA 时，异丙醇是比较好的选择。在室温用异丙醇沉淀减少了一些蔗糖或者氯化钠和DNA 发生共沉淀的现象。但异丙醇还是有一些不足之处： 盐在35 ％的异丙醇溶液中比在65 ％的乙醇溶液中难溶。 DNA 沉 …
阅读更多 »RNA的提取方法及原理
RNA提取原理 RNA提取时，加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA），中间白色薄层（应该是蛋白和DNA），下层有机相（氯仿和蛋白等） 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …
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