2024年 7月 15日, 星期一
新闻

单克隆细胞培养上清的大规模制备

材料(其他材料见单克隆细胞培养上清的制备)

  • 含有5~10mmol /L HEPES 的DMEM 完全培养基和DMEM- 10 完全培养基,pH 为7.2~7. 4
  • 70% (V/ V) 乙醇
  • FBS
  • 10% (m/V) 叠氮钠,可选的
  • 850cm2 滚筒式培养瓶和滚简装置,37°C
  • 250ml 塑料锥底离心管,无菌
  • 离心机转子
  • 0. 45μm 过滤装置,可选的

流程

  1. 增殖杂交瘤(见单克隆细胞培养上清的制备 ,步骤1) ,以1 : 10 的比例分离部分细胞到装有DMEM-10/ 5~ 10mmol/L HEPES 培养基的175 cm2 培养瓶中(使培养液总共100ml) 。为了用蛋白A亲和色谱法纯化MAb, 需单独检测有FBS 的培养基以排除污染(可能会与MAb 一起被纯化出的杂蛋白) 。如果需要,则在无血清培养基中培养细胞。
  2. 当细胞已达到分离移种标准(一般为1 X106~2 X 106 个细胞/ ml) 时,将培养瓶内容物转移到850cm2 滚简式培养瓶中。加入150ml DMEM-10 完全/ H EPES 培养基(使培养液总量达到25 0ml ) 。塞紧瓶塞,置于滚筒装置,于恒温室或培养箱37°C 恒溫培养1~2d 。
  3. 用浸有70%乙醇的纱布擦拭培养瓶口和瓶颈。打开培养瓶.加入250ml 含有 HEPES 培养基的DMEM-10 完全培养液(使培养液总最达到500ml) 。塞紧瓶塞,置于滚筒装置, 37°C 恒温培养1~2d 。
  4. 擦拭瓶口,打开培养瓶,加入2L 含有HEPES 的DMEM- 10 完全培养液(使培养液总量达到2500m l ) ,基本装满整个培养瓶。为防止起泡,先加入培养基,后加入FBS 至培养液总量的10 % 。塞紧瓶塞,置于滚简装置, 37°C 恒温培养至培养基变黄(大约需要5d ;不要过长时间滚动培养瓶,以免细胞发生破碎) 。
  5. 将培养液倒入250ml 锥底离心管。室温下, 250g 离心20min。取上清, 弃沉淀。若不进行培养上清的生物学检测,则加入10 % 的叠氮钠溶液至总员的 0.02% 。若需对培养上清进行亲和色谱或盐析纯化,先用0.45 μm 过滤装置过滤培养上清。将培养上清分装后冰冻储存。

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