2024年 7月 15日, 星期一
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免疫球蛋白G (IgG) 的纯化(二)

基本方案2  蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析

蛋白A 通常用于人(除lgG3外;小鼠lgG1 结合力也较弱)、兔、豚鼠和猪抗体的纯化。

材料

  • 腹水或MAb 上清
  • PBS, pH8.0 和pH 7.3
  • 1mol/L NaOH
  • 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
  • 0.1mol/L 柠檬酸, pH 按照所分离的抗体亚类的需要而定(步骤3)
  • 10% (m/V) NaN3 (可选)
  • 硼酸盐缓冲液(可选)
  • 3mol / L 过滤后的硫氰酸钾
  • 玻璃棉 (Polysciences)
  • 离心机,转子,4 ℃
  • 0. 45μm 滤器,过滤MAb 上清
  • 透析袋
  • 1. 5cmX 10cm 层析柱(如铺有玻璃棉的10ml 注射器)
  • 组分收集器
  • 蠕动泵(可选)

流程

1a. 适用于腹水: 用玻璃棉去除腹水中脂类,用10 倍体积的PBS, pH 8.0 稀释腹水。

1b. 适用于MAb 上清: 于4℃ 将MAb 上清以 20000g 离心后用 0.45μm 滤器过滤。对于 lgG1 抗体,用透析(对pH8. 0 PBS) 或者加入1mol/L NaOH 的方法调整其pH到8.0 。对于其他抗体亚类则调整到pH7. 4.

2. 将蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 装入1. 5cmX 10cm 层析柱中, 连上组分收集器。于4℃ 或室温下用PBS , pH8. 0 平衡层析柱。上样(1ml 至几升)当上样量大时,可用蠕动泵或重力帮助上样。每亳升胶可结合约5mg 小鼠IgG 或 8mg 人IgG。用流式细胞仪或ELISA 检测流出的未结合组分中的抗体活性,以判断上样量是否过量。

3. 用数倍柱体积的PBS, pH8.0 洗柱,一直洗到 A280 到基线水平。用适当pH 的0.1mol/L 拧檬酸缓冲液(用1mol/L NaOH 调整)洗脱目的蛋白:小鼠 lgG1 用pH6. 5 、lgG2 用pH4. 5 、lgG2 和 lgG3 用pH3. 0 。
低 pH 会损伤抗体,因此洗脱前在收集管内按每毫升洗脱液加入50μl 2mol/L Tris-HCl缓冲液,用于立刻中和酸。

4. 合并含目的蛋白的组分,将合并组分倒入透析袋,用含或不含有0.02 % NaN3的1L PBS (pH7.3) 透析,期间更换二次透析液,然后置于 4°C 保存。必要时可用SDS-PAGE 进行纯度鉴定。

5. 层析柱可以先用1 倍柱体积的过滤后的3mol/L 硫氰酸钾清洗,然后再用数个柱体积的PBS pH7. 3 洗柱, 最后保存于4°C 。

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