2024年 7月 20日, 星期六
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免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解(四)

基本方案4   胃蛋白酶水解IgG 获取F (ab’)2 片段的大量制备

材料

  • ≥1mg/ ml 纯化的IgG
  • 适当pH 的乙酸缓冲液 : 0. 2mol/L 乙酸钠,用冰乙酸调至所需pH
  • 2mol/L Tris 碱
  • PBS, pH8.0
  • 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
  • 半胱氨酸,可选
  • 碘乙酰胺结晶,可选
  • 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine
  • 硼酸缓冲液,可选
  • 10% (m/V) NaN3 , 可选
  • 5mm X 100mm 层析柱
  • 26mmX900mm 层析柱

流程

  1. 将浓度≥1mg/ml lgG 对着合适pH 的乙酸缓冲液透析,测定A280值确定IgG 浓度 。
  2. 加入合适pH 的乙酸缓冲液配制0.1mg/ml 胃蛋白酶, 使得E/A 比为1 : 20 。将酶、抗体混合液置于37°C 至所需时间 ,在每毫升反应液中加入约 50μl 2mol/L Tris 碱中止反应。如有需要,用pH 试纸检测pH 是否为8.0, 也可加入更多量 Tris 碱。
  3. 将混合液转至透析袋中, 4°C 下对着1L PBS pH8.0 的缓冲液透析。
  4. 将透析液上样至5mmX 100mm 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 层析柱上,收集未结合的流出液。
  5. 可选:为了减少F (ab’)2 水解成Fab’,加入半胱氨酸至终浓度为0.01mol/L, 混匀,在37°C下孵育2h。如有必要进一步碱化,可以向混合液加入碘乙酰胺0.15mo1/L,用下述步骤纯化去除Fab’ 片段。
  6. 将流出液浓缩至≤5ml  。
  7. 将浓缩液上样至26mmX900mm 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine 层析柱上,用紫外检测器或分光光度计检测洗脱下的蛋白质峰。用SDS-PAGE 法或者预平衡的凝胶层析柱确定片段成分,收集分子质量大小为110kDa 的组分。
  8.  鉴定终产物的纯度,用10%SDS 还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳,上样量为1 ~20μl。在非还原凝胶电泳上, F (ab’)2 片段在110 kDa 处显示一条带,在还原凝胶电泳上, F (ab’)片段在25kDa 处显示为单一条带或为二聚体。
  9. 测A280值,确定F(ab’)2片段浓度。在绷酸缓冲液中的F (ab’) 2 片段可在4°C保存,在含10% (m/V) NaN3的PBS 中的F (ab’)2片段可在- 70°C保存。

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