2024年 7月 20日, 星期六
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免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解(一)

基本方案1   木瓜蛋白酶水解IgG 成Fab 片段摸索性试验

此法适用于小鼠(任何亚类)、大鼠、人、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠和牛的 IgG 水解。

材料

  • 保存于 PBS 中的 2mg/ml 纯化的lgG
  • 木瓜蛋白酶
  • 水解缓冲液:0. 02mol/L EDTA ( 二钠盐) / 0. 02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制,冰上保存<10h)
  • 溶于PBS 的0. 3mol/L 碘乙酰胺
  • PBS
  • 自制的微量透析槽或微量透析盒

流程

  1. 将100μl 2mg/ml 纯化的IgG 加入标有1~24 的24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液,不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶,溶于5ml 水解缓冲液中,浓度分别是0.1mg/ ml 和0. 02mg/ml 。
  2. 将100μl 0.1mg/ ml 木瓜蛋白酶液分别加入8 个IgG 离心管中(酶/抗体比例为1 : 20),将100μl 0.02mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组8 个IgG 离心管中(酶/抗体比例为1 : 100) , 最后,将100μl 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的8 个lgG 离心管中(对照组),所有离心管盖上盖子。
  3. 将所有离心管置于37°C 水浴,在不同时间取出一组离心管,制作水解时间曲线图。一组离心管指一个E/A 比为1 : 20 的水解管, 一个E/A 比为1: 100 的水解管和一个对照水解管。水浴 1h 时取出第一组离心管, 接着在第2h 、4h 、6h、12h、18h 、24h 和 48h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入20μl 0.3mol/L 碘乙酰胺中止水解。
  4. 用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对PBS 透析。
  5. 用150mmX 1. 5mm 10 % 非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析水解产物,上样量为80μl 。当凝胶上在150kDa (表示未水解的抗体)和120kDa (表示仅半胱氨酸起作用)处没有显示蛋白质条带时, 酶切反应完全。选择水解IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件,按基本方案2 进行试验。
    Fab 片段大小为5 0kDa 左右, Fe 片段大小为27kDa, 在24 kDa 和15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。

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