悬浮细胞的培养

材料

• 装在冷冻培养瓶中的HeLa S3 细胞
• 70%（VIV) 乙醇
• 完全MEM-10 培养基， 37°C
• 胰蛋白酶／EDTA, 0. 25% (m/V) 胰蛋白酶／0. 02% (m/V)EDTA, 37°C
• 转瓶完全培养基－5, 37°C
• 25 cm² 组织培养瓶
• 湿润的、37°C 、5%CO₂ 培养箱
• Sorvall H-6000A 转头（或相当的）和50 ml 离心管
• 100 ml 或200 ml 通气转瓶和带滤器的盖

1. 在37℃水浴中融化一支冷冻HeLa S3 细胞的培养瓶，用70％乙醇将培养瓶口消毒，打开培养瓶，用移液管将细胞移入一个25 cm² 的组织培养瓶（装有5 ml 完全MEM-10 培养基）中，转动培养瓶，使细胞均匀地分布，放入湿润的5％ CO₂ 培养箱中37℃培养过夜。
2. 吸出起始培养基，用0. 5 ml 37℃ 胰蛋白酶／EDTA 覆盖细胞，静置30~40 s 。
3. 加入10 ml 转瓶完全培养基－5, 将细胞移入一个50ml 的离心管中，室温下， 1800 g(Sorvall H-6000A 转头为2500 r/ min) 离心5 min, 弃上清。
4. 加入5 ml 转瓶完全培养基－5 ，用吸管来回吹打细胞悬液几次，以分散细胞团块，将悬液移入一个含有50 ml 转瓶完全培养基－5 的100 ml 或200 ml 通气转瓶中。
5. 取出1 ml 细胞悬液，用血细胞计数器计数细胞，加入转瓶完全培养基－5, 使培养物密度达3 X10⁵~4 X10⁵ 个／ml。将细胞放入不含CO₂ 的37℃培养箱中旋转培养。
6. 让细胞生长2 天，每天进行细胞计数并加入转瓶完全培养基－5, 使培养物浓度维持在3X 10⁵~4 X 10⁵ 个／ml 。
7. 取出1 ml 细胞悬液，用血细胞计数器计数细胞，当密度达到3X10⁵~4X10⁵ 个／ml时，用转瓶完全培养基－5 稀释细胞到1. 5X10⁵ 或2. 5X10⁵ 个／ml, 分别于隔日或每天加入。
8. 将一个100 ml 或200 ml 通气转瓶（分别含有50 ml 或100 ml 细胞）放入不含CO₂的37°C 培养箱中旋转培养，每1~2 天传代一次，将细胞密度维持在1. 5X10⁵~5X10⁵个／ml 。