2022年 1月 28日, 星期五
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降落PCR实验原理及步骤

降落PCR(touchdown PCR),一种PCR技术,主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行,例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低,但退火温度过低则会使非特异扩增过多。

实验材料:

基因样品

仪器、耗材:

PCR仪

实验步骤:

1、反应体积为50 μl。

2、人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系:CD137-pCDNA3质粒4 μl,P1,P2各0.5 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。

3、hIgG1Fc片段的PCR扩增体系:含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl,P3、P4各0.4 μmol/L,MgCl22 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。

4、HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系:

(1)第一轮:HBVDNA模板4 μl,P5、P6各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U.

(2)第二轮:取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板,P7、P8各0.25 μmol/L,MgCl1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U。

5、分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分,100℃煮沸5 min,立即冰浴5 min,加入TaqDNA聚合酶,混匀,离心,PCR程序如下:

6、取 10 μl PCR 扩增产物,在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察扩增产物。

注意事项:

由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对,在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时,退火温度的范围应跨越15℃左右,从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃

实验结果分析

1、若无条带:

(1)反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。

(2)PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。

(3)DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。

(4)退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

(5)DNA模板量太少。增加DNA模板量。

(6)引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(7)DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

(8)模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。

2、PCR产物量过少:

(1)延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

(2)变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

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