2022年 1月 28日, 星期五
新闻

慢病毒载体的滴定

一、试剂

完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清(FBS)、慢病毒载体储备液、多聚甲酸( 4%) ( 可选;见步骤15)、青霉素/慢病毒滴定试剂盒链霉素溶液( P/S ) (100 ×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺(海美溴铵) ( 8mg/mL) 、QuickTiter (慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶-EDTA ( 0.05% )、UltraRapid 慢病毒滴度测定试剂盒(可选;见步骤23 )

二、设备

12 孔培养板、流式细胞仪、血细胞计数器、恒湿细胞培养箱(37℃, 5%CO2)、配备观察荧光蛋白滤光片的倒置荧光显微镜、微量移液器、可读450nm 的微孔板酶标仪、带有无菌滤芯的移液器吸头(20μL 、200μL 和1000μL)、无菌试管(1.5mL)

有限稀释法测定病毒滴度

该方案仅适用于293T 细胞功能启动子下表达绿色荧光蛋白的慢病毒。

1 滴定实验前1 天,向12 孔板上含lmL 完全培养基的每孔中接种3 X 105个293T 细胞。轻轻来回晃动倾斜平板确保细胞均匀分布。一块板上只能有一种慢病毒载体储备液。37 °C 、5% CO2细胞培养箱中培养过夜。

2 第1 天,用0.5 mL 37°C 预热的、含8 μg/mL 聚凝胺(1 : 1000 稀释8mg/mL 的聚凝胺储备液)的完全培养基更换孔中的完全培养基。

3 用完全培养基连续稀释慢病毒载体:对于非浓缩储备液,进行1 : 10 、1 :102和1 :103稀释;对于浓缩储备液,进行1 : 102 、1 : 103 、1 :104和1 : 1 矿稀释。每孔加5μL载体稀释液,重复3 次(每个稀释度3 孔) 。对于非浓缩储备液,还包括一组5μL 原液孔。37 °C 培养箱进行培养。

4 第2 天, 加入37 °C 预热的0.5mL 完全培养基。在细胞培养箱中培养2 天。

5 第4 天,小心地移除每孔中的完全培养基,加入lmL PBS 。

6 使用配备观察绿色荧光蛋白滤光片的倒置荧光显微镜,在10 倍物镜下计数每个视野的克隆数目。选择在每个视野中有1 ~2 0 个克隆的稀释度。该稀释度每孔随机计数5 个视野(3 孔X5 视野/孔= 15 个观察视野)计数。计算出平均克隆数/观察视野后,根据如下公式计算滴度
   滴度(TU/mL) = (N× C× D) /0.005
式中, N 为平均克隆数/观察视野; C 为孔面积除以视野面积; D 为载体储备液的稀释倍数。
先确定观察视野的直径(FOVϴ) ,即目镜的视野数(该数值一般写在目镜一侧,例如, 22对应22mm ) 除以物镜放大倍数(如10) ,然后使用公式,面积=  π × (FOVϴ/2)计算观察视野面积。

流式细胞仪测定滴度

7 准备滴定用293 T 细胞,具体见步骤1 。在12 孔板上除了准备必要数目的孔,还要再增加3 个孔。

8 第1 天,对3 个孔进行细胞计数。弃去完全培养基,用1mL PBS 洗涤细胞,加入0.5mL 0.05 %胰蛋白酶-EDTA, 室温下孵育5min 。加0.5 mL 完全培养基充分混匀细胞后转移细胞悬液到1.5mL 试管中,利用血细胞计数器确定细胞浓度。计算出每孔细胞的平均数。

9. 按照步骤2~4 进行滴定。

10 在第4 天,弃去完全培养基,用1mL PBS 洗涤细胞,加入0 . 5mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA, 并在室温下孵育5min 。

11 每孔加0.5mL 完全培养基充分混匀细胞,转移细胞悬液至1 .5 mL 试管中。

12 室温下以500g 离心细胞5 min 。吸弃完全培养基后用1mLPBS 重悬细胞。

13 再次在室温下以500g 离心细胞5min 。弃去完全培养基,用1 ~2mL PBS 重悬细胞。

14 使用流式细胞仪确定荧光阳性细胞的百分比。
如果1h 内不进行分析, 用4%多聚甲醒-PBS 固定细胞30min, 再用PBS 洗涤,在PBS 中4 ℃ 储存。

15 根据如下公式计算滴度(TU/mL)
滴度(TU/mL) = (N× F× D ) /0.005

式中, N 为第1 天每孔细胞平均数; F 是荧光细胞的百分比; D 为载体储备液的稀释倍数。

对转导细胞基因组DNA 上的载体基因组进行PCR 定量以测定滴度

16 . 按步骤1 ~4 进行。

17 第4 天,弃宪全培养基,每孔用1mL 的PBS 洗涤细胞,每孔加入0 .5mL 的0.05 %胰蛋白酶-EDTA, 室温孵育5min 。

18 . 每孔加0.5mL 完全培养基,重悬细胞。将细胞悬液转移至1.5mL 试管中。

19 在室温下以500g 离心细胞5min 。弃培养基,用1mL 的PBS 重悬细胞。

20 在室温下再次500g 离心细胞5min 。

21. 用商业化试剂盒从转导细胞分离基因组DNA, 测定基因组DNA 浓度。

22 利用定量PCR 确定每个靶细胞二倍体基因组上慢病毒载体的拷贝数( Kutner et al.2009) ,也可以按照使用说明书(省略步骤18 ~ 24) ,使用基于定量PCR 的UltraRapid 慢病毒滴定试剂盒。

23 根据如下公式计算慢病毒载体滴度
滴度(TU/mL) = (N × C× D) /0.005
式中, N 是第1 天每孔细胞平均数; C 是每个二倍体基因组中慢病毒载体拷贝数; D 为载体储备液的稀释倍数。

ELISA 测定p24 浓度从而确定滴度

另一种基于转导试验的方法是利用ELISA 测定慢病毒载体储备液中HIV-1 p24 的浓度。

24. 对于非浓缩慢病毒载体储备液,利用OptiMEM 进行1 : 10 和1 :102稀释,每个稀释度重复测定3 次。对于浓缩慢病毒载体储备液,利用OptiMEM 进行1 :102、1 :103和1 : 104 稀释,每个稀释度重复测定3 次。

25 按照使用说明书,使用QuickTiter 慢病毒滴定ELISA 试剂盒测定慢病毒载体储备液中病毒颗粒上p24 的浓度。

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