2022年 1月 28日, 星期五
新闻

如何通过电穿孔转染DNA?

试剂

运载 DNA l0mg/mL

细胞生长培养基

电穿孔缓冲液

指数生长的培养细胞

线性化或环状质粒DNA ( 1 ~ 5μg/μL , 溶于无菌去离子水)

磷酸盐缓冲液( PBS )

胰岛素

设备

电穿孔杯

电穿孔仪器

血细胞计数器

组织培养皿或多孔培养板

组织培养瓶(75cm2

方法

  1. 准备电穿孔用细胞。

细胞

  • 电穿孔前一天,通过胰酶消化释放贴壁细胞,将细胞转移到含新鲜生长培养基的75cm2 细胞瓶中,接种密度应保证电穿孔当天细胞能够达到50%~70%的汇合度(多数细胞系为每次电穿孔1 X 105 ~ 10 X105细胞)。
  • 实验当天,吸出生长培养基, PBS 洗涤细胞,胰酶消化释放贴壁细胞。取胰酶消化的细胞悬液,用血细胞计数板计数细胞密度。细胞悬液于室温下500g 离心5min 。
  • 用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~ 5 X 106 细胞/mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。

对于悬浮细胞

  • 电穿孔前一天,于75cm2 细胞瓶中用新鲜生长培养基稀释细胞, 以保证电穿孔当天细胞能够达到指数生长中期的汇合度( 0. 5 X 106~4 X 106 个细胞/mL ) 。计数细胞并按上述离心收集细胞。
  • 用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~5 X 106 个细胞/mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。

穿

  1. 在电穿孔仪器上设置参数。根据细胞类型选择预设程序或优化程序。对于指数程序(即指数衰减脉冲) , 通常电容为1050μF , 电压在200 ~ 350V 。一般260V 起始电压、以50V递增对大多数细胞有效。内部阻抗设为无限大。
  2. 向电穿孔杯中加入10 ~ 50μg 质粒DNA 。如有必要, 可加入运载DNA,使DNA 总量达到120μg 。
  3. 向电穿孔杯中加入细胞,轻轻反复吹打使细胞和DNA 混匀。
  4. 将电穿孔杯放进电穿孔仪,盖上盖子,进行一次电脉冲。
  5. 立即向电穿孔杯中加入0.5mL 生长培养基,然后将电击后的细胞转移到合适大小的组织培养皿或多孔板中。如有必要, 用生长培养基漂洗0.2cm 或0.4cm 电穿孔杯,然后将漂洗液加到培养皿或培养板内的细胞中。
  6. 对每个样品和每个电压增量均重复步骤5 和步骤6 。记录每个电穿孔杯的实际脉冲时间和时间常数以便于各次实验间的比较。对于哺乳动物细胞,最适条件是场强为400 ~ 900V/cm、脉冲时间或时间常数为10 ~ 40ms 。轻轻晃动平板以使细胞均匀分布于整个孔或培养皿。
  7. 将培养皿或培养板放到含5 %~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养细胞6 ~ 24h 。
  8. 检测细胞活力。
  9. 如要分离稳定转染体,可按分离步骤操作。
  10. 对于瞬时表达,于电穿孔后24 ~96h对细胞进行检测。

 

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