2022年 8月 17日, 星期三
新闻

原位杂交实验流程

1.探针的设计与合成

  • 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列,用premier primer5.0设计引物p81和p82,以卤虫cDNA为模板,PCR扩增得到346bp的产物,回收纯化。

引物编号

引物序列

长度

p81

TGCGGACGAAACAGGAAG

18 bp

p82

GCTCAAACAGTGATGCCAGT

20 bp

  • 目的片段克隆
    1)在无菌离心管中加入连接载体的各种成分,载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下:
    目的PCR片段     5 μl
    pGM-T载体(约50ng/uL) 1 μl
    10×T4 DNA Ligation Buffer   1 μl
    T4 DNA Ligase(3U/uL)   1 μl
    无菌去离子水 3 μl
    总体积   10 μl

    2)轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接,反应结束后将离心管置于冰上。
    3)向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG(50mg/ml)、40 μl的X-gal(20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于37℃培养箱1-3小时,使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。
    4)将10 μl的连接产物加到100 μl DH5a感受态细胞中,轻弹混匀,冰浴半小时,将离心管置于42℃水浴90秒,取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟,其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基,150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟,去掉上清,加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培养12-16小时。
    5)挑取白色菌落直接进行PCR检测,筛选转化子。
    6)将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时,吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。
  • 重组质粒的线性化

取6 μl以测序的重组质粒,选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl:

质粒     6 μl
10xK Buffer  2 μl
NcoI酶 1 μl
0.1% BSA 2 μl
灭菌水 9 μl
终体积   20 μl

取酶切前后的质粒各4 μl,经1%琼脂糖电泳检测,确认酶切完全,将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化,作为探针合成的模板。

  • 探针合成

按试剂盒使用指南,标记反义RNA探针。

使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理,合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

纯化的线形质粒 1 μg
Rnase-free dH2O up to 13 μl
10xNTP labeling mixture 2 μl
10xTranscription buffer 2 μl
Rnase inhibitor   1 μl
SP6 RNA Polymerase  2 μl
总体积   20 μl

稍混匀,短暂离心将反应液集于管底,37℃ 2 h。反应结束后再补加2 μl DNase I,37℃ 15 min,反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取3-5 μl 反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。-20℃保存备用。

2.石蜡切片的制备

◆本实验在杂交结束前均必须保证RNase-free.玻璃器皿采用180℃烘烤10小时。其它采用DEPC处理,高温灭菌锅高温降解DEPC。若仪器不能高温处理,可用3%的H2O2处理半小时以上,DEPC水冲洗干净,烘干。

  • 组织的固定与包埋

选取不同发育时期(0h,5h,10h,15h,20h,40h,3d,5d,7d)的卤虫,经DEPC处理水冲洗表面盐分后,加入新鲜配制的4%多聚甲醛,于4℃固定5-8 h,再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水1 h,50%乙醇脱水1 h,70%乙醇脱水1 h,80%乙醇脱水乙醇脱水1 h,90%乙醇脱水1 h,无水乙醇脱水1 h,无水乙醇脱水1 h,无水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min,二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1)浸蜡30 min,54℃石蜡浸蜡1 h,54℃石蜡包埋。

  • 组织切片:将包埋的组织按7 μm的厚度切片,在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加DEPC处理水,组织片于42℃展片台上展片1小时,再置于40℃恒温箱中烘片12小时后放于4℃密封保存备用。

3.杂交前处理

切片经二甲苯脱蜡2×15 min,无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min,100%-95%-80%-50%-30%乙醇脱水各5 min,后DEPC处理水2×5 min,然后进行杂交前切片处理,具体步骤如下:

  • lxPBS(pH7.4)室温孵育2×5 min。
  • 3%TtitonX-100的PBS中去膜处理15 min。
  • lxPBS洗涤2×5 min。
  • 无RNase的蛋白酶K(20 mg/mL)37℃消化30 min。
  • 100mMGly/PBS中洗2×5 min。
  • lxPBS洗涤2×5 min。
  • 4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
  • lxPBS洗涤2×5 min。
  • 含有25%(W/v)的乙酸酐的100mM的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理15 min(现配现用)。
  • lxPBS洗涤2×5 min。

4.预杂交和杂交

  • 滴加预杂交液于载玻片上,然后置于湿盒中,50℃预杂交2小时。
  • 弃去预杂交液,立即滴加杂交液,置于湿盒中52℃杂交过夜。

5.杂交后处理

杂交完,以后的步骤不必要特意防RNA酶。

  • 弃去杂交液,载片浸入2xSSC中2×15 min。
  • 载片浸入1xSSC中55℃水浴摇动2×15 min。
  • 用含20mg/mL的RNaseA的NTE缓冲液37℃消化30分钟,以去除未结合的探针。
  • 载片浸入5xSSC中55℃水浴摇动2×15 min。
  • 载片浸入5xSSC中室温10 min。

6.抗体反应

  • 用washing buffer清洗组织片5 min。
  • 滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片30 min。
  • 用抗体液覆盖封闭后的组织片,置于湿盒中孵育3h以上。
  • Washing buffer 洗2×15 min。
  • Detection buffer 中平衡2-5 min。

7.显色:加入显色液于湿盒中黑暗静止显色16h

8.封片与观察:

  • 显色合适时,用TE buffer终止着色反应,再用蒸馏水清洗。
  • 滴加封片剂封片,显微镜下观察和摄影。

 

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