PCR (多聚酶链式反应)

PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的,是一种体外复制和扩增DNA的方法。

DNA模板首先在高温下变性,当温度降低时,DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合,在DNA聚合酶作用下,随着温度的缓慢提升,引物逐渐延伸,两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性,引物再次结合,DNA的合成再次进行,这样周而复始,重复20 – 50 次。

一个温度循环装置或可编程序的水浴锅,可以获得整个过程所需要温度的迅速变化。所用的DNA聚合酶是Taq DNA 聚合酶,它来自嗜热菌Thermus aquaticus, 能在高温下工作。整个过程非常简单,问题是任何被污染的DNA都可能被扩增,有时甚至会超过所期望的模板。

一种DNA被另一种DNA污染是PCR 工作者的祸害,这种DNA 片段扩增的可能会导致祥品制备的DNA很容易出现虚假的条带。

 

图一 特殊序列DNA 的PCR 扩增。开始2~3 个循环后,单链几乎没有,主要产物是双链目标序列

PCR实验室中常见的污染来源是前一次PCR过程的产物DNA, 它易在移液和PCR操作中产生气溶胶。正因为这样,许多实验室有一个单独的样品制备区,远离PCR仪和任何PCR 产物可能被暴露的区域。另一个污染源来自皮肤细胞。操作时需要戴上手套。

PCR 的基本法则

  • 远离PCR仪进行样品制备。多数实验室有一个独立的样品制备区,远离PCR仪。无论有没有专门的样品制备区,绝不要在PCR仪附近制备样品。尝试建立一套关于样品制备的严格规则。
  • 配制PCR 反应的移液器和其他的移液器分开使用。正置的移液器会防止气溶胶和样品的交叉污染,带有滤膜的移液头也能防止样品之间的污染。
  • 戴手套。经常更换手套能帮助防止来自表皮细胞的污染。
  • 在反应管内最后加入DNA

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