英格恩技术博客 专注转染等实验

PI染色与流式细胞术

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 2

流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面,用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析,可区别多种细胞的特性,为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。

流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下,通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏,测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。

流式细胞仪常检测的细胞特性

细胞组成 细胞功能
大小 细胞表面/胞浆/核–特异性抗原
粒度 细胞活性
DNA, RNA含量 胞内细胞因子
蛋白质含量 激素结合位点
钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

 

流式检测细胞周期操作步骤

1. 细胞培养:

取对数生长期的细胞,按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。

2. 细胞固定:
800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色:

1500rpm离心5min,弃上清,以3mL的PBS洗涤一次,加入400uL溴化乙锭(PI,50ug/mL),100ul RNase A(100ug/mL ),4℃避光孵育30min。

4. 流式分析:
以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2~3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

注:英格恩CCAA试剂盒基于PI染色(Propidium staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的试剂盒。PI染液即开即用,无需再用缓冲液配制,误差小;而且PI染液4℃存放,无需反复冻融,方便随时取用,试剂更稳定。英格恩CCAA试剂盒是不需要提前用RNA酶消化的超快型试剂盒,常用于贴壁或悬浮细胞的周期与凋亡检测。

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