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将siRNA转染入贴壁动物细胞的转染方案及相关检测

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将siRNA转染入贴壁动物细胞(如哺乳动物细胞系、昆虫细胞系)。
以24孔板siRNA转染为例:

(1) 转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),请使用无抗生素的培养基。
注意:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细胞活力,从而降低细胞的转染效率。而细胞密度过低则可能达不到生长的要求,也会因此影响转染效率。
由于EntransterTM-R4000细胞毒性很低,所以采用本品进行转染的细胞数量相对较少,这有助于提高转染效率。

(2)取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。
注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

(3)取1ul的EntransterTM-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成EntransterTM-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

(4)将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

(5)将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。
注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

(6)转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。
注意:1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。2.在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞状态,可通过换液除去。

(7)沉默效率的检测一般建议的时间为24~72h。

(8)mRNA水平的检测水平的检测:siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解,因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。一般在siRNA转染后24~72h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用Real-time PCR定量检测。

(9)蛋白水平的检测蛋白水平的检测:蛋白水平的检测一般需要借助抗体(针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体)或报告基因系统检测,检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。一般说来,检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响,一般为48~96h,甚至更长时间之后多点采样。

注意事项及建议:
1.实验要求无RNA酶环境,枪头、EP管都要经DEPC处理;
2.整个实验过程,siRNA应于冰上放置,使用完毕,请于-20℃或-70℃保存。
3.为了避免细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验的可靠性和重复性,一般建议:
a. 每次转染实验时,每个转染样品至少设置3个复孔;
b. 接种细胞时,保证每孔接种的细胞数量尽量相同,尽量使细胞在各孔的表面平均分布;
c. 使用“转染siRNA用量参考”的推荐用量和体积,请小心取量,必要时进行相应的优化转染实验。

 

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