英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1．选择合适的转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …
阅读更多 »悬浮细胞的siRNA转染步骤
悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …
阅读更多 »流式检测细胞周期操作步骤
流式检测细胞周期操作步骤 1. 细胞培养： 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。 2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色： 1 …
阅读更多 »通过alamarBlue 法分析细胞活力
水溶性染料 alamarBlue 已用于体外定量多种类型细胞的活力( Fields and Lancaster 1993; Ahmed et al. 1994 ) 。该试剂极其稳定且无毒，因此可用于长时间连续监测细胞( Ahmed et al. 1994 ) 。基于上述原因， alamarBlue法被认为优于MTT 检测等经典的细胞活力检测方法。在一个比较实 …
阅读更多 »电转染实验过程影响因素
1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以 …
阅读更多 »细胞转染效率的影响因素
1.细胞密度 一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 还有，尽量选择无 …
阅读更多 »磷酸钙-DNA共沉淀法的原理和步骤
前些时间有微友在平台上咨询细胞转染的事项，并对一篇博客文章《为什么磷酸钙转染并不稳定？为什么磷酸钙转染并不经济？》比较感兴趣。在这里，对这位微友的疑惑进行更加全方位的了解，在此将磷酸钙转染的原理和步骤和大家分享，以供交流讨论。 核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使 DNA 附在细胞表面，这有利于细胞吞入摄取核酸，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进 …
阅读更多 »慢病毒感染12孔板种植多少细胞合适
在慢病毒感染实验中，12孔板中种植的细胞密度需要根据以下因素优化： 一般种植密度建议： 悬浮细胞： 每孔种植 1×10⁵ 至 2×10⁵ 个细胞。 贴壁细胞： 每孔种植 5×10⁴ 至 1×10⁵ 个细胞。 对于贴壁细胞，建议种植后培养 24小时，让细胞达到约 30%-50% 的汇合度（confluency），然后进行病毒感染。这种密度能确保细胞有充足的分裂 …
阅读更多 »siRNA转染常见问题及解决方案
1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 RNA浓度和转染试剂量的优化(24well) 1 2 3 4 RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg(12.5pmol) 0.33μ …
阅读更多 »有Lenti序列的质粒可以直接转染目标细胞吗
带有Lenti序列的质粒通常不能直接转染目标细胞来实现功能，因为这些质粒设计的初衷是通过病毒介导的基因转导。慢病毒系统需要经过病毒包装步骤后才能有效感染并整合到目标细胞的基因组中。 原因： Lenti质粒本身无法感染细胞：Lenti载体质粒中虽然包含有病毒基因组的部分元件，但缺乏构成病毒颗粒所必需的结构蛋白。要将质粒中的基因传递给目标细胞，必须通过包装细胞来 …
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