细胞转染

      使用Entranster-E试剂进行电转染实验时，要求使用纯度高、无菌且序列正确的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。尝试在250-750nM最终浓度范围内的siRNA浓度。Engreen建议导入一个非靶向或无意义的siRNA控制序列，以验证siRNA的基因特异性。此外，针对具有多个siRNA序列的基因可确保产生的表型不是由于脱靶效应所致 …

慢病毒感染效率低，尽管用胶体金测试显示滴度很高，可能有以下几个原因： 病毒颗粒质量：虽然胶体金检测显示病毒滴度很高，但这并不意味着所有的病毒颗粒都是功能性的。有可能病毒颗粒已经失活或者结构受损，无法有效感染目标细胞。 病毒浓度与效价的差异：胶体金检测主要测量病毒颗粒的数量，但这些颗粒不一定都具有感染性。有效感染的病毒颗粒（感染性单位）可能比实际检测的数量要低 …

1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×10^6-4×10^6细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 3.培养基中的血清 …

      对于engreen的Entranster-E电转染试剂，当使用0.4cm比色杯时，大多数细胞类型的指数衰减脉冲条件在200-300V的电压范围和800-1000μF的电容范围内。对于0.2 cm比色杯时，其范围分别为80-160 V和800-1000μF。对于使用0.4 cm比色杯的电穿孔实验，测试电压范围 …

1.组织培养试剂 优化细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。 基础培养基—目前所使用的各种市售培养基(如，RPMI 1640和DMEM)。培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物 …

不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定 …

1.siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好？ siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR …

miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。 然而，Peng Jin(埃默里大学) 我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRN …

为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致 …

转染效率重复性差： 1. 细胞融合度不同。保证同样的接种量及同样的时间。 2.细菌污染。可使用Entranster试剂，培养基可加抗生素，避免细胞污染。 3.细胞传代次数太高了。可重新复苏一管新的细胞。 4.血清质量不稳定。用同一批号的血清。