英格恩技术博客 专注转染等实验

转染用的质粒,你提对了吗?

老板天天催着要实验进展,是不是很郁闷?可是细胞不给力,是不是很忧郁?刚刚复苏的细胞长的挺好的,可是转染后,细胞状态莫名其妙就变差了,是不是很伤心?转染试剂毒性大,换转染试剂?结果还是一样,是不是很无奈?勉强收了一点点细胞,可是还不够做个western blot的,是不是很抓狂?实验总是不能顺利进行,找不到原因,是不是都要吐血了?没人给指点迷津,是不是心都要碎了?

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告诉你,这个时候要淡定。理清思路,仔细想是不是还遗漏了一个关键因素。对,就是质粒。

做转染实验,质粒的纯度是一定要的。OD值260/280在1.8左右,是一个基本的指标,即没有蛋白和RNA 污染。最重要的是内毒素要清除干净。内毒素清除的效果,才是是否用于转染的决定指标。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,很稳定,需要很长时间高温或强化试剂才能清除干净,对宿主是有毒性的。目前用的质粒大部分是从大肠杆菌中提取出来的。在提取质粒的过程中如果不经过特殊步骤处理是很难将内毒素取出干净的。残存内毒素的质粒倍转染进细胞后就会对细胞造成伤害,即使质粒浓度再高也达不到理想的转染效果。

目前市面上的质粒提取试剂盒林林总总,令人难以取舍。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门,就是有的盒子上写着“Endofree”字样,这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术,高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS,可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒,对于常规的分子克隆实验,如,PCR,酶切,克隆等完全够用了。

要确保用于转染,就看它们有没有真正去内毒素的步骤(注意,过滤或者异丙醇沉淀是无法去除内毒素的),去内毒素主流的就两种方法:1种是qiagen的无内毒素大提取,用离子交换柱子的方法去除。2种是用内毒素清除剂加十分之一体积混匀,离心分相取上清,下相是内毒素),请注意鉴别。

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