英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1. 电穿孔法。通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DN被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率 …
阅读更多 »DNA转染效率低的可能的原因有哪些？
1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细胞污染 细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步 …
阅读更多 »做嘌呤霉素筛选滴定时，感染两天，puro杀3天，5天细胞长得很密原因和解决方法，另外镜下数整个孔的克隆数感觉困难，能换成镜下视野面积与孔面积比换算吗？
问题1：“感染两天，puro杀3天，5天细胞都长很密” 原因： 细胞分裂快（比如 293T）→ 在5天内即使有筛选，还是会长满。 感染率高 → 很多细胞表达抗性，嘌呤霉素筛选不够“稀释” 建议： 缩短时间：感染 24h 后就加 puromycin，第 2 天开始杀，杀 2–3 天就足够。 更稀释的病毒梯度：推荐加大稀释倍数：1:1000，1:5000，甚至 …
阅读更多 »转化细胞在软琼脂中的生长
恶性转化的细胞在许多方面不同于其相应的正常细胞，主要不同在于它们失去了接触抑制生长，获得永生性和在动物宿主体中形成肿瘤的能力。软琼脂培养可作为体外检测细胞转化和致瘤性的替代方法。 材料 2% (w/ v) 琼脂 基础营养培养基，如DMEM ，含24. 6 ％和20% (v/ v) 胎牛血清 单细胞悬液 12 孔培养板 15ml 聚碳酸酣锥形离心管 ，灭菌 对 …
阅读更多 »分步转染，先电转GFP-mRNA，表达很好，然后第二天电转了一个红色荧光DNA质粒，第三天观察的时候只看到了少数细胞有红色荧光，看不到绿色荧光了，这是怎么回事呀？按说GFP已经表达了，怎么还能消失了呢
根据你的描述，GFP在第一天有很好的表达，但在第二天转染DNA质粒后，第三天绿色荧光消失，只有少数细胞有红色荧光。这可能涉及到几个不同的因素： 1. DNA质粒表达对GFP表达的抑制 高浓度DNA引起的翻译抑制：你已经电转过mRNA，然后再转DNA质粒，这可能引发细胞对大分子DNA的免疫反应，比如激活干扰素反应。这可能抑制了翻译，不仅影响红色荧光蛋白（DNA …
阅读更多 »纳米材料转染试剂（Entranster）优势研究
纳米材料转染试剂由纳米高分子聚合物组成，分子内含有许多氨基，在生理PH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面 的负电荷，使DNA 分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA 转移进入细胞，形成内含体(endosome)，DNA从内含体释放， …
阅读更多 »对于难转染的细胞，如何提高其转染效率？
对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。推荐Entranster-E电转染试剂，可将电击对细胞的损伤降到最低。转染效率的确定，常用的是流式细胞仪检测的方法。
阅读更多 »悬浮细胞的分瓶操作步骤
悬浮细胞的分瓶 轻轻的摇匀培养瓶中的细胞培养物，吸出1 ml 到微量离心管中。 对细胞进行计数，同时观察细胞状态。 计算出稀释倍数，决定种子液的量。 吸出适量的细胞到新的培养瓶中。 加入适量的37°C 预热的新培养基。 把细胞放入培养箱，并把盖子松开。 继续培养母液培养物，不加入新的培养基。注意每次传代后都要保留原液作为备份，以防传代后的细胞被污染。在培养瓶 …
阅读更多 »细胞siRNA转染有哪些方法？
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术（Entranster）是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。
阅读更多 »人外周血B 淋巴细胞的转化
EB 病毒的特性之一是能使人外周血B 淋巴细胞转化，使其成为连续分裂，永久生存的类淋巴母细胞样细胞，即永生化细胞。每一永生细胞株都保存了原来提供血样个体的完整基因组，为研究世界上不同人种、不同民族的遗传结构，不同个体、不同人群对疾病的易感性，特别是对家族性遗传疾病和地方性疾病的易感性，提供了宝贵的遗传资源。 （一）材料与设备 1. 无菌材料 细胞培养瓶T …
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