核酸基因

1.探针的设计与合成 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，回收纯化。 引物编号 引物序列 长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp 目的片段克隆1）在无菌离 …

RNA干扰 （RNAi）：近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 MicroRNA（miRNA,微RNA）： …

1、巣式pcr（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性 2、递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃，直到退火温度低于Tm 5℃ 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 3、热启动PCR：抑制 …

小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析，离心机12 或16 管足够一次制备。 一、材料 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体，37’C 振荡培养 灭菌的微桩离心管 冰 溶液I （裂解缓冲液， 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/LEDTA) ，冰上预冷 溶 …

缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris 碱 　 0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸 　 　 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris 碱 　 0. …

【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～ 85％，tRNA占1 …

Northern 杂交可以揭示小RNA 的表达水平，同时也可揭示小RNA 的长度，并且是小RNA 验证和定量的标准。然而， Northern 杂交不能用来检测低丰度小RNA, 也不能检测大量的小RNA 种类。相比之下，定量RT-PCR 更加敏感并且可以适用于高通量处理（图1) 。 图1 小RNA 定量RT-PCR 分析流程图。 试剂 mirVana miRN …

分子克隆最基础的操作可能就是核酸纯化了。去除蛋白质的关键步骤经常是简单地利用酚：氯仿和氯仿把DNA 从水相中萃取出来。这种萃取可在进行一步法克隆操作前有效灭活和去除蛋白酶。然而，如果是从复杂分子混合物如细胞裂解液中纯化DNA 时，则需要更多的检测。在这些情况下， 一般是在用有机溶剂萃取前，利用蛋白质水解酶如链霉菌蛋白酶或蛋白酶K （表1 ) 去除大部分蛋白质 …

原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …

双脱氧测序法速度快。引物的复性和测序可以在60~90 min 内完成。可以同时制备大量的单链或双链测序样品。如果用35 S标记的dNTP 测序，这种方法可以提供极好的（电泳）条带的分辨率。其主要缺点是模板的组成或二级结构有时会导致测序过早地终止。虽然和Klenow 片段相比，有其他的聚合酶可以减轻这个问题，但有些DNA 序列还是无法用双脱氧法精确地测出来。 …