英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺： 双丙烯酰胺（19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液（10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸，用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …
阅读更多 »PCR （多聚酶链式反应）
PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的，是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性，当温度降低时，DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合，在DNA聚合酶作用下，随着温度的缓慢提升，引物逐渐延伸，两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性，引物再次结合，DNA的合成再次进行，这样周而复始，重复20 …
阅读更多 »离心的种类和原理
离心方法主要有两种：制备型（用来分离某些颗粒）和分析型（用来了解分离颗粒的物理性质）。 分子或细胞生物学实验室中所作的决大多数离心机属于制备型离心机，而多数常规制备型离心是差速离心。 g 力和每分钟旋转次数(rpm) 是大略的值：取决于所用的离心机型号和转子。 差速离心（沉淀） 原理：样品在一定速度下离心，分成上清部分与沉淀部分。样品根据沉降速度不同得到分离 …
阅读更多 »如何将胶内物质转移到膜上？
凝胶是厚而易碎的基质，这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交，必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后，滤膜与一个探针温浴，观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记，所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的， 因此， 这种印迹被 …
阅读更多 »构建小RNA 高通量测序文库
小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法，通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应：小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接；以 …
阅读更多 »聚丙烯酰胺凝胶的配制
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml） 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH …
阅读更多 »抑制miRNA 功能的反义寡核苷酸制备
本方案用于设计特异性抑制细胞内miRNA 功能的反义寡核昔酸（ASO ) 。2′-O－ 甲基化修饰的反义寡核苷酸（ ASO ) 可以增加其有效性和抗降解能力， 然而3’端胆固醇修饰可以促进ASO 进入细胞内。 设备 连接互联网的计算机 方法 1 从miRBase ( http://rnicroma.sanger.ac. uk/sequences …
阅读更多 »RNA提取的注意事项
RNA 降解是非常严重的问题，在RNA提取过程中，为防止降解我们需要遵守以下4点基本规则：基本规则1. 把所有接触RNA 的塑料制品以及玻璃制品都高压灭菌。 2. 用于RNA 缓冲液的所有水都要经DEPC 处理。加DEPC 到终浓度0.1% ，再室温放放置过夜，或者灭菌15 min 。DEPC 不能用于Tris 缓冲液，因为DEPC 将会降解成乙醇和二氧化碳 …
阅读更多 »利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA
分子克隆最基础的操作可能就是核酸纯化了。去除蛋白质的关键步骤经常是简单地利用酚：氯仿和氯仿把DNA 从水相中萃取出来。这种萃取可在进行一步法克隆操作前有效灭活和去除蛋白酶。然而，如果是从复杂分子混合物如细胞裂解液中纯化DNA 时，则需要更多的检测。在这些情况下， 一般是在用有机溶剂萃取前，利用蛋白质水解酶如链霉菌蛋白酶或蛋白酶K （表1 ) 去除大部分蛋白质 …
阅读更多 »启动子甲基化调控的miR-148a-3p通过靶向MAP3K9抑制肺腺癌的进展
非小细胞肺癌（NSCLC）占各种肺癌的85%。肺腺癌（LUAD）是NSCLC的主要亚型，其特点是高转移和高死亡率。NSCLC患者的低生存率主要是由于远处转移，占癌症相关死亡的90%。尽管许多治疗策略已经得到应用，但NSCLC的预后仍令人不太满意。缺乏适当的生物标志物和准确的治疗目标以及化疗药物的毒性导致了肺癌的疗效不佳。因此，探索LUAD发生和发展的分子机制 …
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