英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
沉淀DNA 样品能达到浓缩的目的，而且沉淀也会去除阻止许多酶反应的残留氯仿。 一、步骤 于最多体积450 μl 的DNA 样品中，加入1/10体积pH4.2的3 mol/L NaAc, 快速颠倒以混匀。 加入2倍体积95%乙醇或无水乙醇，充分混匀。 样品踩于冷环境中沉淀：-20℃ 过夜，或－70℃30 min, 或干冰中5 min 。 使用干冰进行乙醇沉淀 …
阅读更多 »基因克隆连接到T载体是不是多此一举？
T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。我们都知道，做基因克隆目的基因连接到载体，使目的基因能够在受体细胞进行稳定遗传。部分朋友是把目的片段先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，有部分朋友就直接将PCR产物酶切连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体中。那么进行TA克隆到底是不是多此一 …
阅读更多 »用测序酶进行标记／终止测序反应常见问题
问题 可能的原因 解决办法 四条泳道同一个位置都有条带，特别是靠近引物的地方 DNA 模板不纯 观察对照DNA 是否存在同样问题，如果不存在，重新制备模板DNA 试剂不纯或试剂老化；dNTP量不足 准备新鲜试剂 DNA 聚合酶活性低 使用新鲜制备的酶。 加入更多的酶，如每个反应多加4 倍。使用前再稀释酶． 将标记反应缩减至2 min, 将T7DNA 聚合酶从 …
阅读更多 »揭秘RNAi，缔造实验神话
用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（1-3）后要立刻抽提蛋白，进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …
阅读更多 »ChIP超详细实验步骤
ChIP的一般流程： 甲醛处理细胞—收集细胞，超声破碎—加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合—洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联，纯化富集的DNA-片断 …
阅读更多 »AFLP原理和操作步骤
AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。本AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危 …
阅读更多 »RNA的提取方法及原理
RNA提取原理 RNA提取时，加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA），中间白色薄层（应该是蛋白和DNA），下层有机相（氯仿和蛋白等） 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …
阅读更多 »靶向eIF4G1根除胰腺癌研究
文献标题 Reprograming immunosuppressive microenvironment by eIF4G1 targeting to eradicate pancreatic ductal adenocarcinoma 期刊与影响因子 期刊： Cell Reports Medicine 影响因子：14.3（2024年） 英格恩（Engree …
阅读更多 »构建小RNA 高通量测序文库
小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法，通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应：小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接；以 …
阅读更多 »慢病毒感染后72小时，效率低，细胞已经长满，有什么办法补救？
在慢病毒感染后72小时感染效率较低、细胞已经长满的情况下，可以尝试以下几个措施来提高感染效率并优化实验条件： 细胞传代或重新播种：如果细胞已经长满（汇合度较高），可能会影响慢病毒的感染效率。可以将细胞进行传代，重新播种在新的培养板上，使其达到较低的汇合度（例如30-50%），然后再进行感染。 优化感染时的MOI（Multiplicity of Infecti …
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