英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性，可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的，若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿，应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。 试剂 ASO （ 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照 …
阅读更多 »做无菌实验前，你需要做好这些准备
工作区域尽可能地远离通风口和交通口。不应该开窗工作，也不要靠近门口。通风橱能够帮助无菌状态的保持，但它也不一定完全保证。 确保整洁的工作环境。拿走所有不用的仪器和设备，旧容器和箱子也不要放在近处，做完实验后，收拾干净实验台。 实验前用消毒剂或是清洁剂清洁工作区域。70 ％的乙醇是最常用的（但也要根据不同实验室的情况决定，因为酒精不一定对那些特殊的污染物有效） …
阅读更多 »逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
一、原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的 …
阅读更多 »抑制miRNA 功能的反义寡核苷酸制备
本方案用于设计特异性抑制细胞内miRNA 功能的反义寡核昔酸（ASO ) 。2′-O－ 甲基化修饰的反义寡核苷酸（ ASO ) 可以增加其有效性和抗降解能力， 然而3’端胆固醇修饰可以促进ASO 进入细胞内。 设备 连接互联网的计算机 方法 1 从miRBase ( http://rnicroma.sanger.ac. uk/sequences …
阅读更多 »降落PCR实验原理及步骤
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。 实验材料: 基因样品 仪器、耗材: PCR仪 实验步骤： 1、反应体积为50 μl。 2、人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD1 …
阅读更多 »靶向eIF4G1根除胰腺癌研究
文献标题 Reprograming immunosuppressive microenvironment by eIF4G1 targeting to eradicate pancreatic ductal adenocarcinoma 期刊与影响因子 期刊： Cell Reports Medicine 影响因子：14.3（2024年） 英格恩（Engree …
阅读更多 »丁醇抽提法浓缩核酸
用仲丁醇（ 2 －丁醇）或正丁醇（ 1 － 丁醇）等溶剂萃取水溶液时，部分水分子会进入有机相，而核酸依然留在水相。重复抽提几次后可显著减少核酸溶液的体积。这一浓缩方法可用于减少稀溶液的体积，以使核酸易于通过乙醇沉淀得到回收。 试剂 DNA 样品 异丁醇 方法 计算核酸溶液体积，在2 5 °C 下加入等量的异丙醇。轻微、充分混匀两相。 加入过多的异丙醇 …
阅读更多 »什么是反向PCR？
1、原理 反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. 2、目 …
阅读更多 »Northern Blot原理及所需仪器、试剂
一、原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 二、仪器与试剂 仪器： 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器 …
阅读更多 »实时荧光定量PCR实验步骤
1、样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时 …
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