英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
一、细胞培养瓶、培养皿和培养板 目前，细胞培养已很少使用传统的玻璃制品，如玻璃卡氏培养瓶、玻璃离心管、玻璃试剂瓶，而多数使用一次性的塑料制培养瓶、塑料制离心管及塑料制移液管等，而且这些物品的规格也较丰富，如培养瓶T25、T75 、T150、T175 （阿拉伯数字表示培养面积），现在还出现了培养袋、普通培养板（有不同孔径的，如 6 孔、12 孔、24 孔、48 …
阅读更多 »siRNA细胞转染实验步骤
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那 …
阅读更多 »通过MTT 法分析细胞活力
在众多依赖于活细胞将底物转化为生色产物的活力检测方法中，由Mossman ( 1983 )建立的MTT 法仍是最通用、最流行的方法之一。在MTT 法中，水溶性的黄色染料MTT [3-(4 , 5 － 二甲基噻唑－2)-2 , 5 －二苯基四唑溴盐］ 在线粒体还原酶作用下转化为不溶性的紫色甲臜（ 图1 ) 。随后甲臜被溶解，其浓度通过570nm 下的OD 值被 …
阅读更多 »siRNA转染后目标基因不降反升的原因
一、生物学与分子机制相关原因 1️⃣ 负反馈调控 (feedback regulation) 某些基因被抑制后，会触发细胞的代偿机制。 例如，目标基因下调后，上游转录因子或信号通路被激活，从而 反向上调目标基因 的转录。 特别常见于信号通路核心分子（如 MAPK、PI3K、NF-κB、p53 等）的 knockdown 实验。 建 …
阅读更多 »悬浮细胞的siRNA转染实验步骤
悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …
阅读更多 »电转染实验时，siRNA有什么要求？
使用Entranster-E试剂进行电转染实验时，要求使用纯度高、无菌且序列正确的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。尝试在250-750nM最终浓度范围内的siRNA浓度。Engreen建议导入一个非靶向或无意义的siRNA控制序列，以验证siRNA的基因特异性。此外，针对具有多个siRNA序列的基因可确保产生的表型不是由于脱靶效应所致 …
阅读更多 »电转染实验过程影响因素
1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以 …
阅读更多 »如何达到较高的RNA转染效率？
可从以下几方面进行优化： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如 …
阅读更多 »PD-1沉默对CAR-T细胞影响研究
文献标题 PD-1 silencing impairs the anti-tumor function of chimeric antigen receptor modified T cells by inhibiting proliferation activity 影响因子 8.676（Journal for ImmunoTherapy of Cance …
阅读更多 »siRNA转染常见问题及解答
问：siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？ 答：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。 问：哪种转染试剂效果好？ …
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