细胞生物学

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …

培养细胞后，要时刻观察我们的细胞，无论是用眼睛还是显微镜观察，我们要了解他们的状态，每个实验的培养条件不同，只有时刻了解他们，及时调整，才能做好后续实验。 划重点: 必须熟悉培养的细胞的正常形态，每当拿到一个新的细胞株时，要尽可能多的观察并熟悉细胞的正常生长情况。 当我们从培养箱中拿出细胞培养瓶时: 1.注意看培养基的颜色。多数培养基中都有酸碱指示剂，偏酸性 …

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活的方法。MTT，即四氮唑化合物，能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶发生反应而将淡黄色的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶物甲瓒而沉积在目的细胞中。在一定的细胞数范围内，甲瓒的形成量与细胞数成线性关系。用DMSO将细胞中沉积的蓝紫色甲瓒溶解后，在多功能酶标仪上检测其相应的吸光值，计算细胞浓度。 需注意的是，MTT只能与活 …

1.组织培养试剂 优化细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。 基础培养基—目前所使用的各种市售培养基(如，RPMI 1640和DMEM)。培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物 …

1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构 …

  1.DEAE-葡聚糖。这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。 2.磷酸钙共沉淀转染。最早在197 …

下面以Entranster-H4000，DNA转染试剂为例，简要说明DNA细胞转染实验步骤 1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。 2.转染过程 ⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。 注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。 ⑵将2μl的 …

1. 电穿孔法。通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DN被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率 …

1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …

一、试剂 完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS )、慢病毒载体储备液、OptiMEM-I、青霉素／链霉素( P/S ) 溶液（100×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺（海美溴铵） ( 8mg/mL ) 、QuickTiter 慢病毒滴定试剂盒（慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶－EDTA ( 0.05%) 二、设备 培 …