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细胞转染应该什么时候加抗生素?

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细胞转染分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染外源核酸不整合到宿主染色体中,在短时间内在基因或蛋白水平产生较高的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。稳定转染是相对需要建立某些基因整合到染色体DNA的细胞系来说的,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B 磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染,但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素,就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但脂质体等转染试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡,造成转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是G418选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,使用比含血清培养基更少的抗生素量。

目前转染试剂的改进使得转染全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作,非常方便,省去了污染等麻烦。如,英格恩的Entranster系列。Entranster系列转染试剂由纳米高分子聚合物组成,分子内含有许多氨基,在生理PH下会发生质子化,这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷,使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子,并包裹在其中,使DNA免受核酸酶的降解。转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞,形成内含体(endosome),DNA从内含体释放,进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。在转染过程中可以添加抗生素,抗生素的添加与否不影响转染效率和毒性。

稳定转染操作步骤(H4000,以24孔板为例):

1.前一天,将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞密度在60%左右为宜。

2.将0.8g的DNA用25μl无血清稀释液稀释,充分混匀,制成DNA稀释液。
注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

3.将2μl的EntransterTM-H4000用25μl无血清稀释液体稀释,充分混匀,制成EntransterTM-H4000稀释液。室温静置5分钟。

4. EntransterTM-H4000稀释液分别加入到DNA稀释液中,充分混匀(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上),室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

5.将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上,轻柔混匀。

6. 培养4-6小时后更换培养基。
注意:①如细胞没有毒性等不良情况,转染后4-6小时可不必更换培养基

7. 转染24h后,细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。在G418筛选浓度下持续培养14天后,挑出单克隆,扩大培养.期间每3天换液一次。

8.检测各项指标。

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