细胞转染

在筛选 shRNA 细胞系后，如果你发现 RNA没有变化，但 蛋白水平减少，可能有多种原因。这里有一些可能的解释： 1. 转录后调控（Post-transcriptional regulation） miRNA或其他RNA调控：尽管shRNA能够靶向mRNA并降解其转录产物，细胞内可能存在 miRNA 或其他转录后调控机制（如RNA结合蛋白）影响 mRNA …

可从以下几方面进行优化： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如 …

1.组织培养试剂 优化细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。 基础培养基—目前所使用的各种市售培养基(如，RPMI 1640和DMEM)。培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物 …

1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 3.培养基中的血清 在开 …

    传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如，阳离子脂质体。带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入 …

不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定 …

      对于engreen的Entranster-E电转染试剂，当使用0.4cm比色杯时，大多数细胞类型的指数衰减脉冲条件在200-300V的电压范围和800-1000μF的电容范围内。对于0.2 cm比色杯时，其范围分别为80-160 V和800-1000μF。对于使用0.4 cm比色杯的电穿孔实验，测试电压范围 …

1.细胞密度 　　一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 　　这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 　　还有，尽量选择无 …

荧光表达后的细胞可以在冻存后72小时再测荧光，但有几点需要注意： 细胞存活率：冻存和解冻过程可能会影响细胞的存活率和状态。确保细胞在解冻后恢复良好，具有正常的形态和活力。 荧光稳定性：荧光蛋白的稳定性可能会随时间或细胞状态的变化而有所改变。确保荧光信号在解冻后仍然足够强且稳定。 冻存条件：使用适当的冻存保护剂（如DMSO）并在-80°C或液氮中冻存，以尽量减 …

miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。 然而，Peng Jin(埃默里大学) 我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRN …