蛋白和酶

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生，经常有朋友反映，加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光，可亮光很快就消逝了，压完片后，条带却很弱，甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么？ 要解释这种情况发生的原因，必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光 …

随着亲和层析技术的发展，蛋白纯化技术相对简单，蛋白纯化技术的应用也越来越普遍，一步亲和层析即可达到90%以上的纯度。然而，蛋白纯化的过程中各个环节不容忽视。样品处理，纯化介质的选择，纯化方法的考虑，等等，虽然纯化方法简单，但是蛋白不同，采用的纯化体系也不尽相同。只要达到最终的纯化目的就是最好的纯化方法。 对于亲和层析纯化抗体，不论是蛋白A/G还是特异性抗原亲 …

       荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓 …

特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …

计算蛋白质设计（Computational Protein Design）是一种利用计算机算法来设计具有特定功能和结构的蛋白质分子的方法。该领域的目标是通过计算预测蛋白质的结构与功能关系，以设计出符合特定需求的全新蛋白质或优化已有蛋白质，应用广泛于药物开发、酶工程、生物材料等领域。 计算蛋白质设计的核心步骤 确定设计目标：首先明确蛋白质设计的目标，例如设计具 …

可通过以下几个方面进行改进： 1. 可减少蛋白上样量； 2. 降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间； 3. 如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。 4.选择合适的发光液，比如Enlight。

包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的 …

1. 剪下一段足够装得下要透析物质的透析袋，在每个末端留下大概2 英寸（总共留下4英寸）来捆绑透析袋。（可以买到特殊的管子来进行微量的透析。）2. 透析袋的两端都要打结，或者用透析夹封住末端。3. 用戴手套的手打开透析袋的一个末端，另一个手拿住透析袋，把样品认真地装入透析袋中。4. 扎住或者夹住透析袋的末端，夹住之前先挤压赶走气泡，检查渗漏，尤其注意末端。5 …

降解是蛋白质纯化过程中最害怕发生的事情。 基本规则： 划重点：做关于蛋白质的实验时，手边一定要备一个冰桶，管子从冰箱或者冷冻的状况下取出时马上放到冰上。 1. 必须冷冻离心，因为离心会产热。 2. 了解蛋白质的特性。每一个蛋白质性质差异很大，热会使你的蛋白质变性吗？有二硫键吗？能反复冻融吗？如果你不知道，那假定它不能被冷冻和再解冻是热变性的。 3. 在细胞裂 …

一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板，但也可拷贝RNA ，尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I （全酶）、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段）、T4 …