蛋白和酶

Western Blot是检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化的首选方法，也是实验室常见的实验方法。 完整的Western实验过程比较长，做一次Western也不容易。有结果当然是好的，没有结果也是常有的事，出现各种烦心结果也是时有发生。其中最常见的一种就数显色后背景高了。背景高，目的蛋白颜色对比不明显，要么看不清，图片展示不理想，更 …

       我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存 …

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

• 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 • 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 • 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 • 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤 …

1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为 …

经常有人做Western-Blot会疑惑：为什么做蛋白实验，应该把杂蛋白去除才对，会担心其他蛋白的加入会影响实验结果，增加背景。但为什么偏偏会用加入BSA，脱脂蛋白的方法减少背景呢？ 这需要从Western-Blot的原理说起，Western-Blot中电泳转膜后让蛋白分布NC膜或PVDF膜上，但膜上还有很多地方是空白的，这些空白的地方如果不被封闭，很可能就 …

当细胞被裂解，内容物释放时，蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放，这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …

可溶性蛋白质制备物的冷冻是最常用的保存方法之一。将一支装有蛋白质溶液的试管放入机械冰柜中既简单又方便，在低温中，化学降解的速度通常降低，而且如果冷冻本身不引起蛋白质变性，样品应当稳定几周至几个月，特别是将蛋白质样品保存在-80°C 或更低的温度中。然而，冷冻能够引起蛋白质变性，这是因为一些应激而造成的，这些应激包括：低温、溶质的浓度、冰－液体界面的形成和潜在 …

慢病毒感染效率低，尽管用胶体金测试显示滴度很高，可能有以下几个原因： 病毒颗粒质量：虽然胶体金检测显示病毒滴度很高，但这并不意味着所有的病毒颗粒都是功能性的。有可能病毒颗粒已经失活或者结构受损，无法有效感染目标细胞。 病毒浓度与效价的差异：胶体金检测主要测量病毒颗粒的数量，但这些颗粒不一定都具有感染性。有效感染的病毒颗粒（感染性单位）可能比实际检测的数量要低 …

限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列之内或其附近的特异位点上，井在此切割双链DNA 。它可分3 类，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 I 类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP 的限制（切割）活性。Ⅲ类限制酶在识别位点上切割DNA ，然后从底物上解离。 …