英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
离心方法主要有两种：制备型（用来分离某些颗粒）和分析型（用来了解分离颗粒的物理性质）。 分子或细胞生物学实验室中所作的决大多数离心机属于制备型离心机，而多数常规制备型离心是差速离心。 g 力和每分钟旋转次数(rpm) 是大略的值：取决于所用的离心机型号和转子。 差速离心（沉淀） 原理：样品在一定速度下离心，分成上清部分与沉淀部分。样品根据沉降速度不同得到分离 …
阅读更多 »单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管，无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％汇合时（主 …
阅读更多 »western-blot实验常见问题及解决方案（enlight）
蛋白质的长期保存——在不冻的水溶液中保存
保存蛋白质最方便的方式是在冰箱中（即4~8℃) 以不冻水溶液的形式保存，对于短期保存或蛋白质特别稳定，这是最有效的方法；然而，必须要认识到即使蛋白质不聚集，也会有渐进的化学降解（特别是氧化）。 在溶液条件（优化了天然状态的热力学稳定性）下，聚集能够被最小化，因为蛋白质总体已脱离了部分折叠、能够聚集的种类(Kim et al. 2000) 。例如，大多数蛋白质 …
阅读更多 »蛋白质的保存方法如何选择？
保存方法的选择取决于几个因素，包括蛋白质内在的稳定性、所需的保存时间的长短和对于防止破坏所要求的程度。这些因素有很大的变异性，但是，在大多数情况下都应当遵守以下常规的准则。 如果仅仅是要将小批量的纯化蛋白质保存约几天的时间，那么通常只要以非冷冻的溶液形式4°C保存即可，如果需要保存较长的时间，或如果有明显的蛋白质降解（如可见的沉淀物或不可接受的功能损失），那 …
阅读更多 »真空浓缩仪的使用方法
如果在乙醇沉淀后，核酸中还残留乙醇，就很难用水或缓冲液溶解沉淀。如果你急用或者需要去除大体积的挥发性液体，可以使用真空浓缩设备。真空浓缩设备由离心机、真空泵、加热器和冷凝装置组成，其组合模式多种多样，相关的实验室使用规则变化更多。 一、步骤 使用真空浓缩设备前至少30min 打开冷凝装置。在有些装置中，可能需要加入干冰。 打开真空泵。 开通风管以释放离心 …
阅读更多 »哪些因素会造成western-blot发光时发生荧光“淬灭”？
荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓 …
阅读更多 »2024年诺贝尔化学奖之计算蛋白质设计
计算蛋白质设计（Computational Protein Design）是一种利用计算机算法来设计具有特定功能和结构的蛋白质分子的方法。该领域的目标是通过计算预测蛋白质的结构与功能关系，以设计出符合特定需求的全新蛋白质或优化已有蛋白质，应用广泛于药物开发、酶工程、生物材料等领域。 计算蛋白质设计的核心步骤 确定设计目标：首先明确蛋白质设计的目标，例如设计具 …
阅读更多 »蛋白质的长期保存——以冻结溶液的形式保存
可溶性蛋白质制备物的冷冻是最常用的保存方法之一。将一支装有蛋白质溶液的试管放入机械冰柜中既简单又方便，在低温中，化学降解的速度通常降低，而且如果冷冻本身不引起蛋白质变性，样品应当稳定几周至几个月，特别是将蛋白质样品保存在-80°C 或更低的温度中。然而，冷冻能够引起蛋白质变性，这是因为一些应激而造成的，这些应激包括：低温、溶质的浓度、冰－液体界面的形成和潜在 …
阅读更多 »WB发光检测中常见的问题及解决方法
免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。疫印迹试验（Western blot）是分子生物 …
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