英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（1-3）后要立刻抽提蛋白，进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …
阅读更多 »揭秘RNAi，缔造实验神话
靶向eIF4G1根除胰腺癌研究
文献标题 Reprograming immunosuppressive microenvironment by eIF4G1 targeting to eradicate pancreatic ductal adenocarcinoma 期刊与影响因子 期刊： Cell Reports Medicine 影响因子：14.3（2024年） 英格恩（Engree …
阅读更多 »siRNA表达载体的构建成功要点
对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …
阅读更多 »SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 大量制备
近些年来，随着PCR 技术的出现，以及DNA 克隆和测序方法的发展，对大量质粒载体和重组子的需求也大大减少。因此，本方案曾一度广泛应用，但已经被更为快速和简便的柱纯化方法代替。在本方案中，通过碱裂解法的放大( Bimboim and Doly 1979 ) ，质粒DNA 可从清亮的细菌裂解物中通过含有溴化乙锭的CsCl 梯度离心来进行纯化。 无论是高拷贝数的 …
阅读更多 »慢病毒感染后72小时，效率低，细胞已经长满，有什么办法补救？
在慢病毒感染后72小时感染效率较低、细胞已经长满的情况下，可以尝试以下几个措施来提高感染效率并优化实验条件： 细胞传代或重新播种：如果细胞已经长满（汇合度较高），可能会影响慢病毒的感染效率。可以将细胞进行传代，重新播种在新的培养板上，使其达到较低的汇合度（例如30-50%），然后再进行感染。 优化感染时的MOI（Multiplicity of Infecti …
阅读更多 »在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
向哺乳动物细胞内转染反义寡核苷酸从而抑制miRNA 功能的具体方法参照本方案。通过检测miRNA 靶蛋白水平或携带miRNA 靶基因的3’端非翻译区( 3UTR ) 报道基因的活性来检测ASO 对于miRNA 的效应。本方案主要针对24 孔板设计，如果用其他多孔板、细胞瓶或不同直径培养皿培养细胞，需根据孔／瓶表面积计算细胞密度和试剂体积 试剂 A …
阅读更多 »在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性，可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的，若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿，应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。 试剂 ASO （ 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照 …
阅读更多 »做无菌实验前，你需要做好这些准备
工作区域尽可能地远离通风口和交通口。不应该开窗工作，也不要靠近门口。通风橱能够帮助无菌状态的保持，但它也不一定完全保证。 确保整洁的工作环境。拿走所有不用的仪器和设备，旧容器和箱子也不要放在近处，做完实验后，收拾干净实验台。 实验前用消毒剂或是清洁剂清洁工作区域。70 ％的乙醇是最常用的（但也要根据不同实验室的情况决定，因为酒精不一定对那些特殊的污染物有效） …
阅读更多 »AFLP原理和操作步骤
AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。本AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危 …
阅读更多 »普通PCR的基本原理和注意事项
1、概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. K …
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