选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 细胞的选择 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定 …
阅读更多 »电转染实验时,siRNA有什么要求?
使用高纯度、无菌的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。建议在250-750nM最终浓度范围内的进行siRNA不同浓度的梯度实验。建议设置一个非靶向或无意义的siRNA对照序列,以验证实验siRNA的特异性。同时也验证,针对单个基因用多个siRNA序列实验产生的表型是否是由于脱靶 …
阅读更多 »电转染试剂(Entranster-E)转染Huh7细胞效果图
电转染实验影响因素
1 电场参数 电场是电转染的重要因素,细胞在电场的作用下,膜通透性增加或是形成小孔,以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此,一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以 …
阅读更多 »Hela细胞的电转染条件是什么?
使用Entranster-E电转液与指数衰减脉冲电转仪时Hela细胞的电转染条件是: 对于0.2 cm电转杯,细胞密度为3×10^6 cells/ml,DNA用量为2μg,电转液体积为100μl,电压为130V, 电容为950μF。 对于0.4 cm电转杯,细胞密度为3×10^6 cells/ml,DNA用量为5μg,电转液体积为250μ …
阅读更多 »细胞电转染实验效率不理想的原因
1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期 …
阅读更多 »Jurkat E6-1细胞的电转染条件是什么?
使用Entranster-E电转液与指数衰减脉冲电转仪时Jurkat E6-1细胞的电转染条件是: 对于0.2 cm电转杯,细胞密度为10×10^6 cells/ml,DNA用量为2μg,电转液体积为100μl,电压为150V, 电容为950μF。 对于0.4 cm电转杯,细胞密度为10×10^6 cells/ml,DNA用量为5μg,电 …
阅读更多 »问:现在是将构建好的质粒电转入到自制的感受态细胞里,质粒有10000bp,是90μL感受态细胞中加3.5μ质粒。我之前有电转过6000多bp的质粒,过夜培养可以长菌的。但是这个10000bp的质粒过夜培养没有单菌落,延长培养时间后有个别单菌落,但是挑单菌落到LB中并不浑浊。这种情况我是应该调整一下电转程序还是改一下加入质粒的量呢?
以下是详细的优化建议: 优化质粒用量(首要调整): 问题: 你目前使用的是3.5µL质粒加入90µL感受态细胞。关键在于质粒的浓度(ng/µL),而不是体积。 3.5µL 对于90µL感受态细胞来说体积不小,如果质粒浓度较高,实际DNA量可能大大超过电转最优范围。 原理: 过量的DNA会导致电击时产生过多的热量和离子效应,严重降低转化效率,尤其对大质粒(&g …
阅读更多 »电转染实验时,DNA有什么要求?
使用Entranster-E电转染试剂进行电转染实验时,应使用高纯度、无菌和无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA要求无内毒素,OD值为1.8-2.0。不建议使用微型试剂盒制备DNA,因为它可能含有高水平的内毒素。 不要使用仅用乙醇沉淀法纯化的DNA …
阅读更多 »细胞电转染实验的几点建议
1. 电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2 …
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