英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以 …
阅读更多 »RNA转染效率低的原因是什么？
RNA转染效率低，可能的原因： · 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂，如Entranster试剂。 · 转染试剂和RNA的量不够，或者比例不对。优化实验条件，调整试剂和RNA用量，优化二者比例。 · 检测时间有问题。适当调整检测时间。 · RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 · 细胞状态不佳。调整细胞状态，调整细胞融合度。
阅读更多 »怎样做好siRNA细胞转染实验
1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …
阅读更多 »细胞周期与细胞凋亡分析
CCAA试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是基于PI 染色(Propidium staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的试剂盒。 下面以engreen的CCAA试剂盒为例，说明一下检测方法。 1.收集并调整细胞浓度为1×106/ml，取1ml单细胞 …
阅读更多 »如何做好DNA转染实验？
我认为，要想做好质粒DNA细胞转染实验，应注意以下几点： 1， 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几 …
阅读更多 »监测慢病毒载体储备液中的可复制型病毒
一、试剂 完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS )、慢病毒载体储备液、OptiMEM-I、青霉素／链霉素( P/S ) 溶液（100×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺（海美溴铵） ( 8mg/mL ) 、QuickTiter 慢病毒滴定试剂盒（慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶－EDTA ( 0.05%) 二、设备 培 …
阅读更多 »细胞凋亡检测
方法 细胞类型 特点 说明 形态学／细胞旋转 不限 简单，快速，低廉，贮存无限制 略带主观性，但可靠 Hoechst染色 不限 极快，不能贮存 略带主观性，但可靠 吖啶橙／溴化乙锭 不限 极快，不能贮存 凋亡初期可用，略带主观性，但可靠 电子显微术 不限 耗时，昂贵 可靠 FACS/FSC SSC 非贴壁细胞 简单，须即时进行 客观，仅能提示凋亡 FAC …
阅读更多 »电转染实验时，siRNA有什么要求？
使用Entranster-E试剂进行电转染实验时，要求使用纯度高、无菌且序列正确的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。尝试在250-750nM最终浓度范围内的siRNA浓度。Engreen建议导入一个非靶向或无意义的siRNA控制序列，以验证siRNA的基因特异性。此外，针对具有多个siRNA序列的基因可确保产生的表型不是由于脱靶效应所致 …
阅读更多 »体外培养细胞的一般性质（三）
体外培养细胞的能量代谢 体外培养细胞的主要能量来自葡萄糖。大多数培养液含1 g/L (5.55mmol/L)葡萄糖， 近年来含4.5g/L 葡萄糖的高糖培养液（主要是DMEM 和RPMil640 ) 使用得越来越多。这使得细胞增殖更快。葡萄糖主要被细胞用作糖酵解的碳源，以乳酸为终产物。培养细胞中三狻酸循环（也称拧檬酸循环）仍然活跃，氨基酸作为碳源，特别是谷氨 …
阅读更多 »如何提高siRNA细胞转染效率
为了达到高的siRNA转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RN …
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