英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …
阅读更多 »细胞污染的心得体会
细胞培养的质量好坏是细胞相关实验的基石，许多朋友都曾经历过因为细胞污染影响实验进度的郁闷，被老板批评是小事，要是影响到正常毕业就是大事了。怎么分辨细胞污染，是不是细胞污染？是那种细胞污染？细胞污染后如何处理？ 预防污染 细胞培养是个细致活儿，一不小心就会造成污染，最好养成良好无菌操作习惯。个人经验是，进实验室之前最好洗手，很多实验者都不bother，这是国人 …
阅读更多 »siRNA细胞转染过程中常见问题及解答
问：siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？ 答：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。 问：哪种转染试剂效果好？ …
阅读更多 »siRNA转染后目标基因不降反升的原因
一、生物学与分子机制相关原因 1️⃣ 负反馈调控 (feedback regulation) 某些基因被抑制后，会触发细胞的代偿机制。 例如，目标基因下调后，上游转录因子或信号通路被激活，从而 反向上调目标基因 的转录。 特别常见于信号通路核心分子（如 MAPK、PI3K、NF-κB、p53 等）的 knockdown 实验。 建 …
阅读更多 »体外培养细胞的一般性质（二）
体外培养细胞的功能表达（分化） 由于体外细胞培养的过程是不断选择具有分裂增殖能力细胞群的过程，所以细胞群一直处于变化中。体外的细胞培养物逐渐会变为处于动态平衡的由多能干细胞、未分化的定向前体细胞和成熟细胞组成的细胞群体，并且，这种平衡可随着环境条件变化而改变。在细胞密度较低的情况下，连续传代可促进细胞增殖、限制细胞分化，而高细胞密度、低血清和合适的激素条件， …
阅读更多 »细胞转染效率不可重复怎么办？
转染效率重复性差原因： 细胞融合度不同。保证同样的接种量及同样的时间。 细菌污染。可使用Entranster试剂，培养基可加抗生素，避免细胞污染。 细胞传代次数太高了。可重新复苏一管新的细胞。 血清质量不稳定。用同一批号的血清。
阅读更多 »细胞转染效率低的原因及解决方案
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。 1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细 …
阅读更多 »脂质体细胞转染试剂的缺点
已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8)；如与线粒体膜发生作用(J Biol Chem. 19 …
阅读更多 »AAV病毒感染，tu/ml和vg/ml 的单位如何 换算
在AAV病毒感染实验中，TU/mL（转导单位每毫升，Transduction Unit per milliliter）和vg/mL（病毒基因组拷贝数每毫升，Viral Genome copy per milliliter）是两种常见的病毒滴度单位。它们表示的是病毒浓度的不同方面： TU/mL：代表的是真正具有转导能力的AAV颗粒的数量，也就是能够在宿主细胞中 …
阅读更多 »流式检测细胞周期实验步骤
1. 细胞培养： 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。 2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色： 1500rpm离心5min， …
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